[發明專利]表達人血清白蛋白的靶向載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201310704929.8
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN104726490B
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 王向東;高鵬;魏光偉;李相芝
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;C07K14/765
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 彭成

1.一種表達人血清白蛋白的靶向載體的構建方法，其特征在于：設計特異性引物，進行5’同源臂、3’同源臂和人血清白蛋白基因的擴增；然后，用pBluescriptIISK(+)載體構建同源臂與人血清白蛋白基因融合，然后將融合基因連接到EGFP-ROSA-26基因打靶載體上，再將3’同源臂連接到EGFP-ROSA-26基因打靶載體上，即得表達人血清白蛋白的靶向載體，構建的表達人血清白蛋白的靶向載體包含有人血清白蛋白基因，以及進行同源重組的雞源的兩個同源序列：5’同源臂、3’同源臂，5’同源臂的序列如SEQ ID NO.3所示，3’同源臂的序列如SEQ ID NO.4所示，人血清白蛋白基因的5’端連接有kozak序列，同時還包含有進行藥物篩選的neo基因和報告基因EGFP。

2.根據權利要求1所述的表達人血清白蛋白的靶向載體的構建方法，其特征在于：所述用pBluescript II SK(+)載體構建同源臂與人血清白蛋白基因融合的具體方式為：先將5’同源臂重組到pBluescript II SK(+)載體上，再將人血清白蛋白基因重組到pBluescript IISK(+)載體上，利用特異性引物將5’同源臂與人血清白蛋白基因的融合基因克隆下來。

3.根據權利要求1或2所述的表達人血清白蛋白的靶向載體的構建方法，其特征在于：所述特異性引物如下：用于擴增5’同源臂的引物為F1、F2：F1：

5’-CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA-3’；如SEQ ID NO.5所示；F2：

5’-CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG-3’；如SEQ ID NO.6所示；用于擴增人血清白蛋白基因的引物為F3、F4：F3：

5’-CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3’；如SEQ ID NO.7所示；

F4：5’-CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’；如SEQ ID NO.8所示；用于擴增3’同源臂的引物為F5、F6：F5：

5’-TTCCACATCCACCGGTTGGTTTATTTAGAGTGGCA-3’；如SEQ ID NO.9所示；F6：5’-GTTGGCGCCTACCGGACTGGCAGGGCTTATTTTCA-3’；如SEQ ID NO.10所示；引物F7，F8用于將連接到pBluescript II SK(+)載體上的5’同源臂+人血清白蛋白基因克隆并加上infusion試劑連接所需的同源臂：F7：

5’-TCTTTCCAGTGGTTAGCTCTATGGCGTCAAAGGTC-3’；如SEQ ID NO.11所示；F8：5’-ATACGAAGTTATTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3’；如SEQ ID NO.12所示。

4.權利要求1所述方法構建的表達人血清白蛋白的靶向載體在制備轉基因雞中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：具體應用時，將權利要求1的表達人血清白蛋白的靶向載體轉化雞的原始生殖細胞，經過培養篩選后，利用顯微注射技術，將轉化成功的原始生殖細胞注射入雞胚胎中，培育出轉基因雞。

6.一種獲得表達人血清白蛋白的轉基因雞的方法，其特征在于：通過同源重組的方法將權利

要求1所述的表達人血清白蛋白的靶向載體重組入雞的卵清白蛋白基因中，然后將轉化成功的重組細胞注射入雞胚胎中，培育出轉基因雞。

7.一種制備生物反應器的方法，其特征在于：所述生物反應器由轉基因雞輸卵管組成，方法包括用權利要求1所述的表達人血清白蛋白的靶向載體制備轉基因雞。

8.一種從轉基因雞輸卵管產生人血清白蛋白的方法，其特征在于：通過同源重組的方法將權利要求1所述的表達人血清白蛋白的靶向載體重組入雞的卵清白蛋白基因中，然后將轉化成功的重組細胞注射入雞胚胎中，培育出轉基因雞，培育轉基因雞雌雄性個體至性成熟并傳代，然后從轉基因雞雌性個體所產的雞蛋中分離純化人血清白蛋白。

9.根據權利要求8所述的從轉基因雞輸卵管產生人血清白蛋白的方法，其特征在于：培育轉基因雞雌雄性個體至性成熟并傳代后，分析F0或F1代雌性轉基因雞個體所產的雞蛋蛋清組分中人血清白蛋白的含量，選擇高產個體作為生物反應器的宿主動物或作為生物反應器種雞。