[發(fā)明專利]一種基于微流控芯片和核酸適配體識(shí)別技術(shù)的腺苷檢測方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310702881.7
• 申請(qǐng)日: 2013-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN103713138A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張何;傅昕;胡鑫江
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南工程學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微全分析系統(tǒng)的生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于微流控芯片和核酸適配體識(shí)別技術(shù)的腺苷檢測方法。

背景技術(shù)

腺苷是一種內(nèi)源性核苷，因其在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)表達(dá)中的重要作用，受到廣泛關(guān)注及研究。同時(shí)腺苷作為腺苷脫氨酶的作用底物，其含量變化也會(huì)間接反應(yīng)腺苷脫氨酶的體內(nèi)代謝水平，而腺苷脫氨酶活性的檢測對(duì)于臨床許多疾病的診斷都具有重要參考價(jià)值，因此發(fā)展腺苷的新型檢測方法對(duì)于醫(yī)學(xué)臨床診斷及機(jī)體代謝水平具有重要意義。傳統(tǒng)腺苷檢測方法主要為HPLC、紫外檢測、流式檢測法及熒光分析法等技術(shù)，這類技術(shù)檢測靈敏度有限，而且需要較大體積的檢測溶液，使得在高靈敏微量分析領(lǐng)域的應(yīng)用受到局限。微流控微珠陣列芯片是微流控芯片研究領(lǐng)域中發(fā)展的一種新型芯片模式，該技術(shù)的發(fā)展較好解決了微量樣品條件下高通量、高靈敏檢測的難題，同時(shí)檢測過程簡單，不需要昂貴的檢測儀器，為發(fā)展未來自動(dòng)化高性能生物分子檢測平臺(tái)技術(shù)提供了新的方向。

核酸適配體是指通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)從隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸文庫中篩選的能特異結(jié)合蛋白或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸，長度一般為25-60個(gè)核苷酸。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、易修飾、易固定、可反復(fù)使用、可長期保存及沒有或極小的免疫原性等特點(diǎn)，而且與目標(biāo)分子結(jié)合表現(xiàn)出高效、專一的特性，因而核酸適配體生物傳感器在蛋白質(zhì)研究、藥物檢測、醫(yī)學(xué)診斷等方面得到廣泛應(yīng)用。酶功能化納米顆粒作為一種檢測標(biāo)記材料，由于一個(gè)納米顆粒上能攜帶多個(gè)酶分子，已經(jīng)成為信號(hào)放大技術(shù)領(lǐng)域中的一種極具應(yīng)用前景的信號(hào)放大方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種基于微流控芯片和核酸適配體識(shí)別技術(shù)的腺苷檢測方法，將微流控芯片、核酸適配體識(shí)別、多酶納米信號(hào)放大技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，發(fā)展了一種用于腺苷檢測的高性能生物傳感技術(shù)，將具有廣闊的應(yīng)用前景。其技術(shù)方案如下：

一種基于微流控芯片和核酸適配體識(shí)別技術(shù)的腺苷檢測方法，包括以下步驟：

(1)生物素修飾的腺苷核酸適配體和生物素修飾的酪蛋白通過生物素-親合素結(jié)合方法固定于親合素修飾微球的表面形成功能化微球，所述微球固定在微流控芯片檢測區(qū)的相應(yīng)微型小室中，形成微流控微珠陣列檢測芯片；

(2)將辣根過氧化物酶和巰基修飾的捕獲探針修飾到納米顆粒上作為信號(hào)標(biāo)記；

(3)將步驟(2)形成的功能化納米顆粒流入微流控微珠陣列檢測芯片的檢測區(qū)與微珠陣列雜交，洗脫后流入腺苷溶液與雜交微球孵育，由于腺苷核酸適配體能與腺苷結(jié)合形成特定的空間構(gòu)型，會(huì)導(dǎo)致功能化納米顆粒從微球表面脫離；

(4)流入過氧化物酶底物溶液，通過多酶納米信號(hào)放大技術(shù)將生物素化的酪胺結(jié)合到微球表面的酪蛋白上，洗脫后流入親合素標(biāo)記的量子點(diǎn)，所述量子點(diǎn)能與微球表面酪蛋白上結(jié)合的生物素識(shí)別并固定；

(5)通過計(jì)算流入腺苷后微球表面熒光與未流入腺苷微球表面熒光的比值對(duì)腺苷進(jìn)行定性和定量。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(1)中所述的功能化微球表面修飾的生物素修飾的腺苷核酸適配體和生物素修飾的酪蛋白，其摩爾濃度比值為1∶100～1∶120。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(1)中所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯類有機(jī)聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的任意一種。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(2)中所述的納米顆粒為金納米顆粒、二氧化硅納米顆粒和聚苯乙烯納米顆粒中的任意一種。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(3)中所述的腺苷溶液與雜交微球孵育，孵育時(shí)間為20～25min。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(4)中所述的過氧化物酶底物溶液包含0.007％～0.009％H₂O₂、250～350μM生物素化的酪胺、50～100mM的NaCl。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(4)中所述的量子點(diǎn)為CdSe、CdTe、CdS和復(fù)合型量子點(diǎn)中的一種，其發(fā)射范圍為400nm～700nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明微流控芯片具有微量檢測和高通靈敏檢測的雙重特性，能夠較好的解決常規(guī)分析方法中微量檢測、高靈敏檢測以及高通量分析等性能難以兼容的問題，可實(shí)現(xiàn)微量樣品的高靈敏分析；本發(fā)明采用多酶納米信號(hào)放大及量子點(diǎn)熒光技術(shù)，可高靈敏檢測分析目標(biāo)，能夠檢測0.1pM的腺苷，而且實(shí)現(xiàn)了血清樣品中腺苷的特異及準(zhǔn)確的定量分析；本發(fā)明的建立為腺苷的微量及高靈敏檢測提供了一種有力的檢測手段。