[發(fā)明專利]一種原始生殖細(xì)胞的爬片方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310702097.6
• 申請(qǐng)日: 2013-12-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103674653A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于福先;潘建治;朱志偉;陳曉宇;黃菁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種原始生殖細(xì)胞的爬片方法。

背景技術(shù)

原始生殖細(xì)胞（Primordial?germ?cells,?PGCs）是形成生殖細(xì)胞的前體細(xì)胞，在性成熟的個(gè)體中生能夠特異性的生成精子和卵子（Durcova-Hills?G等,?PloS?one,??2008.3:?e3531）。家禽作為卵生動(dòng)物，單個(gè)胚胎較難獲得，因此PGCs細(xì)胞的研究尤為重要，隨著PGCs細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立，以PGCs細(xì)胞為基礎(chǔ)的現(xiàn)代保種技術(shù)研究以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究得以迅速發(fā)展。

PGCs細(xì)胞是一種理想的制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的原料。2006年，Marie-Cecile?van?de?Lavoir等人成功建立了雞PGCs細(xì)胞在體外的長(zhǎng)期培養(yǎng)技術(shù)，體外培養(yǎng)至200天左右的PGCs細(xì)胞仍具有生殖干細(xì)胞的特性，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白，經(jīng)篩選后注入孵化至13-15期的受體雞胚中，獲得可進(jìn)行生殖細(xì)胞系遺傳的轉(zhuǎn)基因雞（van?de?Lavoir?MC等,?Nature,?2006.?441:766-9?）。2012年，Tae?Sub?Park等人通過(guò)?piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染PGCs細(xì)胞獲得了可表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因雞，并對(duì)外源基因在染色體上的位置進(jìn)行了定位（Park?TS等,?PNAS,?2012.?109:?9337-41）。同年，Joni?Macdonalda等人也通過(guò)piggyBac?和?Tol2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染PGCs細(xì)胞獲得了轉(zhuǎn)基因雞（Macdonald,?J.等,?PNAS,?2012.?109:?e1466-72.）。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李贊東教授根據(jù)PGCs細(xì)胞的發(fā)育特性，選擇在雞胚發(fā)育至13-15期時(shí)，血管注射慢病毒載體，成功獲得了可遺傳的轉(zhuǎn)基因鵪鶉，與傳統(tǒng)的胚盤(pán)下腔注射法相比，G1后代的轉(zhuǎn)基因效率可提高7倍（Zhang?Z等,?PloS?one,?2012.?7:?e50817）。

PGCs細(xì)胞可用于的現(xiàn)代保種研究。早在1989年，Wentworth?BC等就證實(shí)了鵪鶉的PGCs細(xì)胞可用于制備生殖細(xì)胞系遺傳的嵌合體鵪鶉（Wentworth?BC等,?Poultry?science,?1989.?68:?999-1010）。2005年，Yonghong?Song等人將孵化至27期的雞胚性腺中分離的PGCs細(xì)胞注入Busulfan處理的發(fā)育至15-17期的受體雞胚血管中，提高了供體雞的生殖細(xì)胞嵌合率（Song?Y等,?Mol?Reprod?Dev,??2005.?70:?438-44.）。2008-2010年間，?Yoshiaki?Nakamura等人通過(guò)Busulfan處理方法的改進(jìn)，獲得了只產(chǎn)生供體雞的生殖細(xì)胞嵌合體雞（Nakamura?Y等,?Reprod?Fertil?Dev,?2008.?20:900-7；Nakamura?Y等,?Biol?Reprod,?2010.?83:?130-7）。為了簡(jiǎn)化操作程序，2012年，Yoshiaki?Nakamura等人又通過(guò)優(yōu)化X射線照射的方法，提高了供體雞胚的生殖細(xì)胞嵌合率（Nakamura?Y等,?J?Reprod?Develop,?2012.?58:?432-7）。同年，Marie-Cecile?van?de?Lavoir等人對(duì)1只雄性雞胚的PGCs細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，使約200個(gè)的PGCs細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，經(jīng)含有綠色熒光蛋白基因的載體轉(zhuǎn)染后，篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，并注入珍珠雞的血管中，獲得了生殖細(xì)胞系遺傳的嵌合體珍珠雞，通過(guò)采集珍珠雞精液與供體母雞的雜交，獲得供體雞，實(shí)現(xiàn)了PGCs細(xì)胞在異種動(dòng)物間的遺傳（van?de?Lavoir?MC等,?PloS?one,?2012.?7:?e35664）。

PGCs細(xì)胞可用于以PGCs細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因表達(dá)調(diào)控研究、現(xiàn)代育種保種研究以及轉(zhuǎn)基因研究，具有一定的科研價(jià)值。

現(xiàn)有的原始生殖細(xì)胞的爬片方法為：將載玻片放于培養(yǎng)皿中，加入飼養(yǎng)層細(xì)胞，待飼養(yǎng)層細(xì)胞在載玻片上生長(zhǎng)成單層后，使用絲裂霉素或γ-射線處理終止其分裂后，加入PGCs細(xì)胞，經(jīng)過(guò)約24小時(shí)的培養(yǎng)，PGCs細(xì)胞吸附于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，完成細(xì)胞爬片，取出載玻片，PBS洗滌后，使用4%的多聚甲醛或其它固定液進(jìn)行固定并進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，整個(gè)過(guò)程需2天以上的時(shí)間，耗時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種原始生殖細(xì)胞的爬片方法的技術(shù)方案。

所述的一種原始生殖細(xì)胞的爬片方法，其特征在于包括以下步驟：

1）對(duì)原始生殖細(xì)胞進(jìn)行純化；

2）對(duì)純化后的原始生殖細(xì)胞采用PBS洗滌3次，離心收集細(xì)胞；