[發明專利]對氧磷酶1基因的表達純化方法

在審

• 申請號: 201310701927.3
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN104726497A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 張耀洲;譚淑敏;李杰;王小飛;蓋其靜
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/55;C12N9/16
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 孫艷敏

技術領域

本發明屬于基因工程和蛋白工程技術領域，具體涉及對氧磷酶1基因的表達純化方法。

背景技術

對氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)在研究有機磷中毒預防和治療方面具有重要作用，但目前天然PON1很難獲得，利用大腸桿菌表達的PON1雖然廉價且生產周期短，但獲得的蛋白因缺少糖基化及磷酸化修飾，在體內應用時存在免疫排斥，半衰期短，易降解等問題。

目前雖然也有通過基因工程方法表達出具有活性的PON1基因的報道，但未能得到純化的重組蛋白，也就沒有比較完善的對氧磷酶1的表達純化方法。

發明內容

為了解決現有技術中表達、純化具有活性的PON1基因困難的問題，本發明提供了一種對氧磷酶1基因的表達純化方法。

本發明的對氧磷酶1基因的表達純化方法，步驟如下：

（1）擴增對氧磷酶1基因，連接到轉移載體pFastBac^TM1上構建重組轉移載體，重組轉移載體轉化大腸桿菌DH10Bac感受態細胞，獲得含有對氧磷酶1基因的重組桿狀病毒DNA，將重組桿狀病毒DNA轉染家蠶BmN細胞使其在細胞內復制裝配成含對氧磷酶1基因的重組病毒；

（2）步驟（1）的重組病毒接種家蠶五齡幼蟲，發病后取蠶血，經離心過濾除雜并經濃縮后用汽巴藍親和層析以及抗體親和層析純化蠶血，獲得對氧磷酶1蛋白。

優選地，上述對氧磷酶1基因的表達純化方法中，步驟（1）所述擴增使用的引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO:?1~2所示。

優選地，上述對氧磷酶1基因的表達純化方中，步驟（2）所述離心為4℃條件下以10000?rpm的轉速離心30?min；所述過濾除雜是采用9層醫用紗布過濾后再經過0.45μm濾膜；所述濃縮是用10?kD超濾管進行。

優選地，上述對氧磷酶1基因的表達純化方法中，步驟（2）所述汽巴藍親和層析使用的固定相為汽巴藍瓊脂糖-3GA3000-CL。

優選地，上述對氧磷酶1基因的表達純化方法中，步驟（2）所述抗體親和層析所用抗體是通過原核表達的對氧磷酶1基因四次免疫新西蘭雄兔后取血然后通過ProteinA純化制得。

本發明的有益效果：通過設計引物，構建重組病毒vBm-PON1，將其接種家蠶五齡幼蟲，使其表達目的蛋白PON1，通過汽巴藍親和層析和抗體親和層析純化得到了純度較高的PON1。此方法解決了天然PON1含量低，純化難得問題，為以后研究PON1功能奠定基礎。

附圖說明

圖1為重組轉移載體pFastBac^TM1-PON1的雙酶切-PCR鑒定圖M：DNA?ladder?marker；1：雙酶切產物；2：PCR產物。

圖2為重組Bacmid-PON1的PCR鑒定圖；M.DNA?ladder?marker，1.PON1?F/PON1R?PCR產物，2.?PON1?F/M13R?PCR?產物，3.?M13F/PON1R?PCR?產物，4.?M13F/M13R?PCR產物。

圖3為重組桿狀病毒BmNPV-PON1在家蠶五齡幼蟲中表達產物的SDS-PAGE圖，M.蛋白質低分子質量標記，1.?接種野生病毒的蠶血，2.?接種重組病毒的蠶血。

圖4為重組桿狀病毒BmNPV-PON1在家蠶五齡幼蟲中表達產物的Western?blotting鑒定圖，M.?蛋白質低分子質量標記，1’.?接種野生病毒的蠶血，2’.?接種重組病毒的蠶血。

圖5為純化蠶血的SDS-PAGE鑒定圖，M.：蛋白質低分子質量標記，1：接種野生病毒的蠶血，2：接種重組病毒的蠶血原樣，3：汽巴藍親和層析柱初步純化的蠶血，4：抗體親和層析柱進一步純化的蠶血。

圖6為純化蠶血的Western?blotting鑒定圖，M.：蛋白質低分子質量標記，1’：接種野生病毒的蠶血，2’：接種重組病毒的蠶血原樣，3’：汽巴藍親和層析柱初步純化的蠶血，4’：抗體親和層析柱進一步純化的蠶血。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好地理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。

生物材料及試劑來源：