[發明專利]一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶

有效

• 申請號: 201310699636.5
• 申請日: 2013-12-18
• 公開（公告）號: CN103614350A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 陳堅;聞一凡;張娟;堵國成;顧磊;劉曉筱
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶，屬于酶工程技術領域。

背景技術

葡萄糖氧化酶是生物領域中最主要的工具酶之一，自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面將其應用于血糖測定以來，GOD被廣泛應用于食品飼料醫藥等相關領域。

在食品工業中，由于氧的存在引起許多不利于產品質量的化學反應，并為許多微生物生長創造了條件。目前許多國家已將GOD作為公認的安全抗氧劑而廣泛應用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于將葡萄糖氧化形成過氧化氫和葡萄糖酸。利用其專一氧化酶的原理制成葡萄糖氧化酶分析儀能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量指導生產。在醫藥工業中GOD作為試劑盒酶電極等用于血清（漿）尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑牙垢和齲齒的形成，防止口腔疾病和牙病的發生。此外由于可以催化生成H₂O₂，還可用于對H₂O₂敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境調節飼料消化促進動物生長。含葡萄糖氧化酶乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑可用于預防牲畜胃腸道感染腹瀉并有促進動物生長作用。

從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細菌GOD產酶量少；一般采用黑曲霉和青霉屬菌株作為GOD生產菌。我國及美國均采用點青霉及產黃青霉生產GOD，日本常用尼奇青霉，俄羅斯用生機青霉。近年報道膠霉屬（Clioctadium）、擬青霉屬（Paecilomyces）和帚霉屬（Scopulariopsis）也能生產GOD。

產量低、酶活低、檢測方法復雜是GOD產業化的限制性因素，國內外為此做了大量工作并取得了明顯進展。目前國外生產的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的TOYOBO。規模化生產高活性的GOD還有困難。發酵生產GOD的同時產生大量雜蛋白分離提取復雜成本高。同時，葡萄糖氧化酶在生物傳感器方面一直有著很廣泛和重要的應用前景。繼人們采用葡萄糖氧化酶和葡萄糖氧電極而檢測血糖水平之后，第二代傳感器采用人工電子受體（又被稱為電子介質或氧化還原染料）以代替氧作為電子受體。然而這一應用仍存在一些問題，譬如：采用氧化酶（GOD）的電子介質型生物傳感器很容易受到樣品中的溶解氧影響，因此采用對氧低敏感度的氧化酶相對來說具有很大的優勢。本發明旨在提供一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶。

發明內容

本發明提供了一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶突變體，是以SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列為出發序列，將第524位的甲硫氨酸M突變為亮氨酸L；所得突變葡萄糖氧化酶命名為M524L。

編碼SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述突變體M524L的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發明還提供了一株產所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌，是以畢赤酵母（Pichia?pastoris）GS115為宿主，以pPIC9K為載體，表達編碼所述葡萄糖氧化酶突變體的基因。

所述基因工程菌的構建方法包括如下步驟：PCR或化學合成得到編碼突變體M524L的基因，連接表達載體pPIC9K，將重組質粒轉化P.pastoris?GS115，獲得基因工程菌。

利用所述基因工程菌發酵產葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟：（1）將攜帶突變基因的基因工程菌活化后，在30℃、200rpm下培養至OD₆₀₀=1.6-1.7，作為種子液；（2）將種子液以2%（v/v）的接種量轉入基本發酵培養基，于30℃、200rpm條件下發酵培養；（3）當在基本發酵培養基中培養至OD₆₀₀=1.2-1.5時，收集菌體，將酵母細胞轉入誘導培養基中誘導蛋白的產生。

所述基本發酵培養基為BMGY培養基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g，100mM?pH6.0的磷酸緩沖液。

所述誘導培養基為BMMY培養基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g，100mM?pH6.0的磷酸緩沖液。