[發(fā)明專利]一種檢測17β-雌二醇的電化學免疫傳感器的制備方法及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310696497.0
• 申請日: 2013-12-18
• 公開（公告）號: CN103675062A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 黃加棟;李杰;劉素
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N27/30
• 分類號: G01N27/30;G01N33/53
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于納米材料和食品添加劑檢測領域，提供了一種檢測17β-雌二醇的的電化學免疫傳感器，可以用于檢測食品中的17β-雌二醇。

背景技術

雌激素是一種G?18類固醇激素，目前在人體中發(fā)現(xiàn)的雌激素有三種：雌二醇、雌酮和雌三醇，其中雌二醇的生物活性最強。雌二醇可以和體內(nèi)雌激素受體結合，改變內(nèi)分泌系統(tǒng)正常的生理功。由于其合成代謝的作用而用于畜牧生產(chǎn)中以期促進增長，而低濃度的雌激素可以引起人類性發(fā)育的異常，減少人類精子的數(shù)量。在歐盟一些國家，雌激素已經(jīng)禁止用于畜牧業(yè)。因此，迫切需要建立一種快速便捷的檢測方法來檢測環(huán)境中存在的雌激素的含量。目前檢測17β-雌二醇的方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法等，但這些方法具有檢測成本高，樣品處理復雜且時間較長，儀器操作復雜等缺點。

發(fā)明內(nèi)容

本文研究了一種快速便捷，靈敏度和精確度都較高的電化學免疫傳感器檢測食品中的17β-雌二醇，操作簡單，成本低廉。在玻碳電極的表面修飾一層可以增加電化學信號的納米復合物，然后將17β-雌二醇完全抗原通過和修飾在電極表面的金之間的靜電引力吸附在電極表面。我們制備17β-雌二醇抗體和辣根過氧化物酶的標記層，將其和游離的17β-雌二醇的標準品同時滴加在電極表面，這樣電極表面修飾的完全抗原和游離的標準品競爭結合標記的抗體。清洗電極以后，結合在電極表面標記層上的辣根過氧化物酶催化底物過氧化氫產(chǎn)生電信號。利用電信號的變化就可以達到待測物檢測的目的。

本文發(fā)明內(nèi)容之一是提供了一種新型電化學免疫傳感器的制備方法。

本文發(fā)明內(nèi)容之二是將制備的免疫傳感器用于檢測食品中的17β-雌二醇。

本文發(fā)明的技術方案，包括以下步驟：

1、檢測17β-雌二醇的電化學免疫傳感器的制備步驟如下：

(1)石墨烯-聚苯胺的制備：

25?mg的GO溶于50?ml?1?mol/L?H₂SO₄中，超聲1?h，形成分散均勻的溶液。加入200?μL的苯胺單體再超聲30?min。加入0.06?g的(NH4)₂S₄O₈，20?℃超聲2?h。得到的復合物通過過濾收集，60℃干燥。

(2)?抗體和辣根過氧化物酶標記層的制備：

?2?ml?1%的H₂PtCl₆·6H₂O加入到8?ml?水中，80℃攪拌狀態(tài)下加入1%的硼氫化鈉溶液，攪拌4?h，得到PtNPs。5.0?mg的多巴胺加入到5.0?ml?PtNPs溶液中，用Tris–HCl將pH?調(diào)節(jié)至8.5，室溫下攪拌5?h。離心用水清洗三次，得到多巴胺功能化的PtNPs。在將其加入到含有20?mg檸檬酸鈉的HAuCl₄溶液中，室溫下攪拌兩個小時。離心清洗得到PDA-PtNPs-AuNPs納米材料，溶于5?ml水中備用。100?μL，1mg/mL的辣根過氧化物酶?(HRP)?和100?μL，5?μg/mL的雌二醇抗體?(Ab)加入到2?ml的上述材料中，4℃下攪拌一夜。用PBS緩沖溶液清洗三次，得到納米復合物標記層PDA-PtNPs-AuNP-HRP-Ab.

(3)?檢測17β-雌二醇的電化學免疫傳感器的制備步驟如下：

5?mg?GO-PANI超聲1h溶于5?mL?DMF中，滴加20?μL的GO-PANI溶液在玻碳電極表面，室溫下晾干；將修飾的電極浸在含有1?mM?HAuCl₄?and?1?mM?H₂PtCl₆的0.2?M的Na₂SO₄溶液中，通過恒電位方法進行掃描還原，掃描電位為-0.2?V，掃描時間是300?s。這樣在GO-PANI表面修飾了一成Au-PtNPs的納米合金。滴加10?μl，10?μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修飾好的電極表面，室溫下干燥5?h。用10?μl?BSA?(1%)封閉殘余的活性位點。每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。得到制備的免疫傳感器電極，4℃儲存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->

2、如上所制備的一種檢測17β-雌二醇的電化學免疫傳感器，用于檢測17β-雌二醇的步驟如下：

(1)?滴加10?μl抗體標記層和10?μl游離的17β-雌二醇標準品在制備的電極表面，室溫下培養(yǎng)30?min，用PBS緩沖溶液沖洗未結合的抗體和標準品。