[發明專利]一種降解獲得及檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法

有效

• 申請號: 201310695277.6
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103698426A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 張麗娟;韓章潤;曾洋洋;蘭瑩;邱培菊
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將硫酸軟骨素或透明質酸脫乙酰化，得脫乙酰硫酸軟骨素或脫乙酰透明質酸；

(2)將步驟(1)所得脫乙酰硫酸軟骨素或脫乙酰透明質酸亞硝酸降解，得硫酸軟骨素二糖或透明質酸二糖；

(3)將步驟(2)所得二糖濃縮至干，溶解于水中，調節pH值為堿性，加入吡唑啉酮類衍生試劑，反應完成后用氯仿萃取三次去除多余的衍生試劑；

(4)用液相色譜(LC)法或液相色譜質譜聯用(LC-MS)法檢測步驟(3)所得衍生后的二糖。

2.如權利要求1所述的一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，其特征在于，步驟(1)所述的脫乙酰化反應步驟包括：

將硫酸軟骨素或透明質酸溶于含有N₂H₄·H₂SO₄的N₂H₄·H₂O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到90-110℃，反應5-16h，反應完成后，凍干，除去N₂H₄得脫乙酰硫酸軟骨素或脫乙酰透明質酸。

3.如權利要求1所述的一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，其特征在于，步驟(1)所述的脫乙酰化反應步驟包括：

將硫酸軟骨素或透明質酸溶于含有N₂H₄·H₂SO₄的N₂H₄·H₂O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到98℃，反應9h，反應完成后，凍干，除去N₂H₄得脫乙酰硫酸軟骨素或脫乙酰透明質酸。

4.如權利要求1所述的一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，其特征在于，步驟(2)所述的亞硝酸降解反應步驟包括：

將脫乙酰硫酸軟骨素或脫乙酰透明質酸濃縮至干，溶于水中，加入pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5℃條件下反應，調節pH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0-5℃條件下反應，加入氨水終止反應，得硫酸軟骨素二糖或透明質酸二糖。

5.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，其特征在于，步驟(1)所述的脫乙酰化反應步驟中硫酸軟骨素或透明質酸與N₂H₄·H₂O溶液的質量體積比(mg/mL)為1∶0.5-1，N₂H₄·H₂O溶液中含10％N₂H₄·H₂SO₄。

6.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，其特征在于，步驟(2)所述的亞硝酸降解步驟中脫乙酰硫酸軟骨素或脫乙酰透明質酸水溶液與亞硝酸鈉水溶液、亞硝酸、氨水的體積比為1∶1∶1∶0.6。

7.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，其特征在于，步驟(3)所述的硫酸軟骨素二糖或透明質酸二糖與吡唑啉酮類衍生試劑的質量比為1∶6-60。

8.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，其特征在于，步驟(3)所述的吡唑啉酮類衍生試劑包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)。

9.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測硫酸軟骨素二糖的方法，其特征在于，步驟(3)所述的吡唑啉酮類衍生試劑包括PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP中的一種或任意幾種聯用。