[發明專利]一種降解獲得及檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法

有效

• 申請號: 201310695277.6
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103698426A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 張麗娟;韓章潤;曾洋洋;蘭瑩;邱培菊
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于醫藥領域涉及一種降解獲得及檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法。

背景技術

硫酸軟骨素(CS)是一類由糖醛酸(葡萄糖醛酸，GlcA或艾杜糖醛酸，IdoA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)為二糖重復單元組成的有硫酸根修飾的線性高分子多糖，GlcA與GalNAc以β-1，3糖苷鍵相連，IdoA與GalNAc以α-1，3糖苷鍵相連，雙糖單位之間由β-1，4糖苷鍵相連，包括硫酸軟骨素A(CSA)、硫酸軟骨素B(CSB)、硫酸軟骨素C(CSC)、硫酸軟骨素D(CSD)和硫酸軟骨素E(CSE)等。已有相關的藥物或是保健品上市，如硫酸軟骨素片、硫酸軟骨素注射液、硫酸軟骨素滴眼液、硫酸軟骨素膠囊等。不同種類的硫酸軟骨素硫酸化程度及硫酸根位置不同，CSA的二糖單位是GlcA-GalNAc4S，主要來源于軟骨；CSB的主要二糖單位是IdoA-GalNAc4S，來源于皮膚；CSC的二糖單位是GlcA-GalNAc6S，來源于鯊魚軟骨；CSD的二糖單位是GlcA2S-GalNAc6S，來源于海膽。

透明質酸(Hyaluronic?acid，HA)是糖胺聚糖中的一種，屬于酸性粘多糖，廣泛分布于人體各部位。透明質酸是由葡萄糖糖醛酸(GlcA)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)為二糖重復單元組成的高分子線形多糖。GlcA與GlcNAc之間由β-1，3糖苷鍵相連，雙糖單位之間由β-1，4糖苷鍵相連。分子中兩種單糖按1∶1的摩爾比組成，雙糖單位可達25000之多，在體內透明質酸的分子量從5KDa到20000KDa不等。透明質酸有多種生物功能，已被開發成多種藥物用于眼睛外科手術、關節修復注射液、傷口愈合、外科手術防粘劑等。尤為重要的是，透明質酸具有特殊的保水作用。透明質酸由于其具有獨特理化性質和生理功能，在生物材料方面亦得到了廣泛應用。

分析不同類型的CS和HA，主要是對其二糖組成進行分析。傳統的分析方法是用相應的裂解酶，如硫酸軟骨素酶ABC降解，通過強陰離子交換柱分離不同二糖，與市售的二糖標準品比對保留時間進行定性，再通過各二糖標準品對檢測器響應值和物質的量的標準曲線進行含量分析，從而確定該多糖的結構。如王皓等采用離子交換色譜從Wistar大鼠腎臟中提取糖胺聚糖，用軟骨素酶ABC降解糖胺聚糖中的硫酸軟骨素組分，對二糖組成分析(王皓，于廣利，趙峽，等.大鼠腎臟糖胺聚糖的種類及二糖組成分析[J].光譜學與光譜分析,2010(9)：2484～2487.)。對于透明質酸的分析，鮑倫軍等建立了一種用軟骨素酶ABC酶解-高效液相色譜測定魚翅中的HA的方法(鮑倫軍，楊建成，何振華，等.軟骨素酶ABC酶解高效液相色譜法測定魚翅中的透明質酸[J].色譜,2002(06)：557～559.)。但是用酶降解硫酸軟骨素時，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)脫水后形成結構相同的脫水糖醛酸，從而失去了硫酸軟骨素中葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)的相對含量信息，而且裂解酶不能將CS或HA完全降解為二糖。酶、強陰離子交換柱和二糖標準品都非常昂貴，并且酶容易失活、性質不穩定，檢測步驟繁瑣，樣品消耗量大，檢測時間長，分析結果的重復性差。所以亟需一種高效、操作簡單、穩定的檢測CS和HA二糖的方法。

發明內容

針對以上現有技術存在的不足，本發明提供一種全面、高效、簡單、穩定且成本低的檢測硫酸軟骨素二糖和透明質酸二糖的方法，本發明的另一目的是提供一種可將硫酸軟骨素和透明質素完全降解為相應二糖化學降解方法。

實現上述發明的技術方案是：

1.一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，包括如下步驟：

(1)將硫酸軟骨素或透明質酸脫乙酰化，得脫乙酰硫酸軟骨素或脫乙酰透明質酸；

(2)將步驟(1)所得脫乙酰硫酸軟骨素或脫乙酰透明質酸亞硝酸降解，得硫酸軟骨素二糖或透明質酸二糖；

(3)將步驟(2)所得二糖濃縮至干，溶解于水中，調節pH值為堿性，加入吡唑啉酮類衍生試劑，反應完成后用氯仿萃取三次去除多余的衍生試劑；

(4)用液相色譜(LC)法或液相色譜質譜聯用(LC-MS)法檢測步驟(3)所得衍生后的二糖。

步驟(3)衍生反應方程式為：

當X＝H，Y＝H時，反應物為PMP；當Y＝H，X＝D時，反應物為D3PMP；當Y＝D，X＝H時，反應物為D5PMP；當Y＝D，X＝D時，反應物為D8PMP。式中的二糖可以是以下提到的任意二糖。

2.一種檢測硫酸軟骨素和透明質酸二糖的方法，步驟(1)所述的脫乙酰化反應步驟包括：