[發(fā)明專利]具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310695256.4
• 申請(qǐng)日: 2013-12-13
• 公開（公告）號(hào): CN103695373B
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李宗金;韓忠朝;冷良;韓之波;徐旸;趙錢杰;王悅冰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開大學(xué);北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/62;C12N15/867;A61P35/00
• 代理公司: 北京英創(chuàng)嘉友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11447
• 代理人: 耿超,王浩然

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞治療領(lǐng)域，涉及一種具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的細(xì)胞。

背景技術(shù)

目前，乳腺癌已經(jīng)成為全世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重地威脅著女性的身心健康。在當(dāng)今技術(shù)條件下，其原發(fā)腫瘤病灶可以通過手術(shù)進(jìn)行根治，但是手術(shù)給患者帶來極大的痛苦。目前多應(yīng)用化療進(jìn)行治療，大多數(shù)化療藥物并不能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞，在對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生一定殺傷作用，從而產(chǎn)生毒副作用，往往并不能獲得長(zhǎng)期生存，且花費(fèi)巨大。找到一種能夠靶向多發(fā)的腫瘤病灶部位的載體，將抗癌藥物或基因特異性運(yùn)輸?shù)侥[瘤病灶，而不對(duì)周圍的正常組織造成影響將顯著提高治療效果，減低副作用。近年來有研究應(yīng)用骨髓、胚胎或臍帶中分離得到的內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)性地腫瘤靶向治療，雖然被證實(shí)具有一定的有效性，但這類內(nèi)皮前體細(xì)胞來源有限且不易獲得，難以應(yīng)用于臨床。人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，其在體外能夠進(jìn)行擴(kuò)增，如果能夠被證實(shí)具有腫瘤靶向性，將對(duì)應(yīng)用于臨床治療具有重要意義。同時(shí)，為了觀測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，并監(jiān)測(cè)載體細(xì)胞在體內(nèi)的分布、增殖和機(jī)體排斥的過程，可以應(yīng)用體內(nèi)分子成像技術(shù)，其具有微創(chuàng)、直觀、動(dòng)態(tài)觀察的特點(diǎn)，并能夠?qū)ν恢粍?dòng)物在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，能夠很好地評(píng)估靶向治療的療效。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決目前應(yīng)用于試驗(yàn)性腫瘤靶向治療的臨床局限性，提供一種具有能夠進(jìn)行體內(nèi)示蹤并具有腫瘤治療作用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及制備方法。

本發(fā)明提供的具有體內(nèi)示蹤和腫瘤治療作用的融合細(xì)胞，是由人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、經(jīng)攜帶有海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和胸苷激酶的三融合基因的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后構(gòu)建而成，該細(xì)胞能夠進(jìn)行體內(nèi)示蹤，并在給予胸苷激酶底物更昔洛韋后誘導(dǎo)融合細(xì)胞的凋亡。

本發(fā)明所涉及的細(xì)胞的制備和腫瘤靶向治療、體內(nèi)示蹤的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

1、本發(fā)明所述的具有腫瘤治療作用并且能夠進(jìn)行體內(nèi)示蹤的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的制備方法，其具體步驟為：

第1、構(gòu)建含海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合基因的具有Bsd抗性的慢病毒表達(dá)載體；

第2、用293T細(xì)胞鋪六孔板，密度為1.5×10⁶細(xì)胞/孔，用于轉(zhuǎn)染；

第3、用Lipo-2000將第1步中構(gòu)建的三融合基因慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入第2步前鋪板的293T細(xì)胞；

第4、第3步293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染16小時(shí)后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，換液后24小時(shí)收集病毒上清，儲(chǔ)于-80℃冰箱備用；

第5、用人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞鋪六孔板，密度為1×10⁵細(xì)胞/孔，用于病毒感染；

第6、待第4步中的病毒上清常溫化凍后，混合2毫升不含抗生素的全培養(yǎng)基和1毫升第4步中的病毒上清加入間充質(zhì)干細(xì)胞孔內(nèi)，并加入Polybrene 24μg/孔，1600rpm，37℃離心1小時(shí)；

第7、離心結(jié)束后換新鮮全培養(yǎng)基2毫升/孔，繼續(xù)置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；

第8、48小時(shí)后向經(jīng)病毒感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞加入Bsd進(jìn)行藥篩共計(jì)3天，以得到穩(wěn)定表達(dá)海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，即轉(zhuǎn)基因間充質(zhì)干細(xì)胞。

2、體內(nèi)腫瘤靶向治療：

⑴用胰酶消化生長(zhǎng)良好的野生型或標(biāo)記螢火蟲熒光素酶和綠色熒光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培養(yǎng)基重懸至1×10⁷細(xì)胞/毫升；

⑵對(duì)6-8周齡雌性Nude小鼠腹部?jī)蓚?cè)分別經(jīng)原位注射100微升上述腫瘤細(xì)胞懸液，待2周后，腹部形成腫瘤灶，建成Nude小鼠乳腺癌模型；

⑶用胰酶消化攜帶海腎熒光素酶、紅色熒光蛋白和自殺基因胸苷激酶三融合蛋白的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，用PBS洗一遍并用DMEM/F12基本培養(yǎng)基重懸至1×10⁷細(xì)胞/毫升；

⑷經(jīng)瘤內(nèi)向乳腺癌模型Nude小鼠每側(cè)腫瘤注射100微升上述間充質(zhì)干細(xì)胞懸液；

⑸經(jīng)腹腔注射更昔洛韋0.5mg，每日2次，兩次給藥中間間隔12小時(shí)，連續(xù)4天；

⑹重復(fù)上述步驟⑷-⑸4次。

3、體內(nèi)化學(xué)發(fā)光成像：

⑴監(jiān)測(cè)腫瘤病灶生長(zhǎng)情況：向乳腺癌模型Nude小鼠腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分鐘后利用Xenogen IVIS Lumina II活體成像系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，曝光時(shí)間為30秒；