[發明專利]一種pRBE-HCR-hAAT-hFIXml質粒及其構建和應用

有效

• 申請號: 201310693612.9
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103667346A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 許正新;陳金中;葉娟;張阿敏;謝林俊
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種pRBE-HCR-hAAT-hFIXml質粒及其構建和應用。

背景技術

在自然界的許多天然的轉基因事件中，有一些事件在長期進化過程中被證明是安全的。其中，人類基因組最具有意義的是其19號染色體上有一個被稱之為AAV病毒的整合位點AAVS1（adeno-associated?virus?integration?site1）。自然情況下，AAV僅僅整合在AAVS1；在體外實驗條件下，也有超過75%的AAVITR（inverted?terminal?repeat）附加的基因可以在rep蛋白指導下整合在AAVS1。

迄今為止，國內外的一系列研究成果都未發現任何已知人類疾病與AAV感染相關。此結論的重要性在于：該結論是以成年人大于90%的AAV感染率為前提得出的，具有高度可靠性，而AAV結構中的關鍵成分Rep蛋白和介導整合的順式元件——位于AAV?ITR或位于P5啟動子內的核心元件16bp?RBE（rep?binding?element），已經多次體內、外實驗證實，可以構成可靠的定點整合轉基因系統（Hum?Gene?Ther.2010;21(6):728-38.Gene?Ther.2009;16(5):589-95.J?Mol?Biol.2006;358(1):38-45.）。

然而，單純的含有此16bp?RBE的定點整合轉基因系統還存在著體外介導整合的效率尚可，體內介導整合的效率不高、基因表達產物的量有待進一步提高的缺點（Gene?Ther.2009;16(5):589-95.）。而hAAT啟動子和HCR（hepatic?locus?control?region）元件可以增加以上定點整合轉基因系統的體內表達效率（Mol?Ther.2001;3(6):948-57.Mol?Ther2000;1(6):522-32.J?Surg?Res.1994;56(6):510-17.）。因此，將定點整合系統所需核心元件和肝特異性調控元件（hAAT啟動子、HCR元件）結合起來構建一個新的轉基因表達系統，則可以在提供定點整合、保證安全的前提下提高轉基因的表達效率。

發明內容

本發明描述了一種pRBE-HCR-hAAT-hFIXml的構建和應用。

本發明所述的pRBE-HCR-hAAT-hFIXml，序列如SEQ?ID?NO.17所示，其含有hAAT啟動子、RBE元件和HCR調控元件。

所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml的構建方法，是將hAAT啟動子和HCR調控元件插入去除了CMV啟動子的pRBE-CMV-FIXml的位點Nhe?I和Bgl?Ⅱ之間得到pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。

構建方法具體包括以下步驟：

1）pRBE-CMV-FIXml去CMV啟動子載體獲得

以pRBE-CMV-FIXml為模板，引物兩端分別加入了酶切位點Bgl?II、Nhe?I，以這兩引物擴增不含CMV啟動子的質粒骨架；PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒純化；

2）hAAT片段擴增及pT-hAAT的構建

以人基因組DNA為模板，用含Nhe?I的上游引物和含Bgl?Ⅱ的下游引物擴增獲得Nhe?I-hAAT-Bgl?ⅡDNA片段，將此片段用Nhe?I和Bgl?Ⅱ酶切后連接于T載體，得到pT-hAAT；

3）HCR片段擴增

以人基因組DNA為模板，用含Spe?I的上游引物和含Spe?I的下游引物擴增獲得Spe?I-HCR-Spe?I?DNA片段；

4）pT-HCR-hAAT構建

用Nhe?I酶切T-hAAT，用DNA凝膠回收試劑盒純化，與用Spe?I酶切回收的HCR片段連接后，獲得pT-HCR-hAAT；

5）HCR-hAAT片段的PCR擴增

以pT-HCR-hAAT為模板，用含Nhe?I的上游引物和含Bgl?Ⅱ的下游引物擴增獲得Nhe?I-HCR-hAAT-Bgl?ⅡDNA片段；

6）pRBE-HCR-hAAT-hFIXml構建

“Nhe?I-HCR-hAAT-Bgl?Ⅱ”雙鏈DNA片段進行Nhe?Ⅰ和Bgl?Ⅱ雙酶切，通過DNA重組技術插入經Nhe?Ⅰ和Bgl?Ⅱ雙酶切的pRBE-CMV-FIXml重組質粒，獲得pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。