[發(fā)明專利]一種pRBE-HCR-hAAT-hFIXml質(zhì)粒及其構(gòu)建和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310693612.9
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103667346A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許正新;陳金中;葉娟;張阿敏;謝林俊
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種pRBE-HCR-hAAT-hFIXml質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒的序列如SEQ?ID?NO.17所示，其含有hAAT啟動子、RBE元件和HCR調(diào)控元件。

2.一種制備權(quán)利要求1所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml質(zhì)粒的方法，其特征在于，hAAT啟動子和HCR調(diào)控元件插入去除了CMV啟動子的pRBE-CMV-FIXml質(zhì)粒的位點Nhe?I和Bgl?Ⅱ之間得到pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）pRBE-CMV-FIXml去CMV啟動子載體獲得

以質(zhì)粒pRBE-CMV-FIXml為模板，引物兩端分別加入了酶切位點Bgl?II、Nhe?I，以這兩引物擴增不含CMV啟動子的質(zhì)粒骨架；PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒純化；

2）hAAT片段擴增及pT-hAAT的構(gòu)建

以人基因組DNA為模板，用含Nhe?I的上游引物和含Bgl?Ⅱ的下游引物擴增獲得Nhe?I-hAAT-Bgl?ⅡDNA片段，將此片段用Nhe?I和Bgl?Ⅱ酶切后連接于T載體，得到質(zhì)粒pT-hAAT；

3）HCR片段擴增

以人基因組DNA為模板，用含Spe?I的上游引物和含Spe?I的下游引物擴增獲得Spe?I-HCR-Spe?I?DNA片段；

4）pT-HCR-hAAT質(zhì)粒構(gòu)建

用Nhe?I酶切pT-hAAT，用DNA凝膠回收試劑盒純化，與用Spe?I酶切回收的HCR片段連接后，獲得pT-HCR-hAAT；

5）HCR-hAAT片段的PCR擴增

以pT-HCR-hAAT為模板，用含Nhe?I的上游引物和含Bgl?Ⅱ的下游引物擴增獲得Nhe?I-HCR-hAAT-Bgl?ⅡDNA片段；

6）pRBE-HCR-hAAT-hFIXml構(gòu)建

“Nhe?I-HCR-hAAT-Bgl?Ⅱ”雙鏈DNA片段進行Nhe?Ⅰ和Bgl?Ⅱ雙酶切，通過DNA重組技術(shù)插入經(jīng)Nhe?Ⅰ和Bgl?Ⅱ雙酶切的pRBE-CMV-FIXml重組質(zhì)粒，獲得pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。

4.權(quán)利要求1所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml用于將外源基因hFIXml定點整合于人染色體的AAVS1特定位點，使哺乳動物體內(nèi)穩(wěn)定表達hFIX的用途。