[發明專利]一種快速檢測轉基因大豆MON89788的實時熒光PCR方法

有效

• 申請號: 201310693528.7
• 申請日: 2013-12-18
• 公開（公告）號: CN103725777A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 黃明;劉欣;祝長青;黃繼超;周興虎
• 申請（專利權）人: 南京佳邦食品有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種快速檢測轉基因大豆MON89788的實時熒光PCR方法。

背景技術

大豆是我國乃至全世界重要的經濟與糧食作物，是食用油和植物蛋白最豐富、最廉價的來源。為了提高大豆的產量，滿足人們對大豆的需求量，科研人員采用基因工程與分子輔助育種方法，培育了一些高產、優質和抗逆以及適合農場機械化種植的轉基因大豆品種。國際農業生物技術應用服務組織（ISAAA）的年度報告顯示，2012年，全球約81%的大豆產量為轉基因大豆。上世紀末中國就已開始耐除草劑轉基因大豆的進口，轉基因大豆及其相關的加工產品越來越多地進入到食品與飼料鏈中。轉基因作物在解決全世界日益嚴重的糧食危機的同時，也帶來了食品安全和環境安全方面的諸多爭議，世界各國都在逐步加強對重要目標食品中轉基因大豆品系的監測與標識工作。

監測與標識工作的實施依賴于轉基因產品檢測技術，轉基因檢測技術包括蛋白質檢測技術和核酸檢測技術，其中實時熒光PCR技術，以其高特異性、高靈敏性和可定量等優點，越來越多的應用于轉基因產品檢測中。轉基因生物的PCR檢測主要是對轉基因植物外源插入片段的選擇性擴增。根據擴增的目標核酸的位置的不同，PCR檢測策略可以分為四種，即篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構建特異性PCR檢測和品系特異性PCR檢測。與前三種方法相比，品系特異性PCR檢測是通過檢測外源插入載體與植物基因組的連接區DNA序列，具有非常高的特異性和準確性。品系特異性PCR檢測已經成為目前轉基因檢測方法研究的重點，并逐步地為國際檢測標準和國際各檢測實驗室所采用。

不論采用基于核酸或蛋白質的方法，在轉基因檢測時均必須使用標準物質作為陽性對照或制作標準曲線，以對轉基因產品進行準確檢測。目前，轉基因作物及其產品檢測所需的標準物質主要來源于植物原材料，但是這類標準物質制備、貯存和測定過程受很多因素影響，很難維持恒定的量，很難保證測量的穩定性，而且并非所有的轉基因品系都存在標準物質，給轉基因產品檢測帶來很大困難，同時也制約了轉基因作物檢測技術的發展。相比之下，標準分子在很多方面具有優勢，標準分子是一種含有外源目的基因和內標準基因特異性片段的重組質粒分子，具有易獲得，純度高，經濟高效等優點，近幾年，質粒標準分子已逐漸成為一種可替代植物基因組DNA?的一種標準物質，質粒標準分子的研制具有廣闊的發展前景。

轉基因大豆MON8978品系是美國孟山都公司研發抗草甘膦大豆品種，已先后在美國、加拿大、日本和哥斯達黎加四國商業化種植，并在菲律賓、澳大利亞、新西蘭、墨西哥等11個國家和地區批準用于食品和飼料加工原料。我國雖然不種植轉基因大豆，但是每年進口幾千萬噸轉基因大豆用于食品或飼料加工原料，轉基因大豆MON89788已于2011年批準進口我國用作加工原料。為加強轉基因大豆MON89788的安全監管，滿足轉基因標識的需要，有必要開發適用于轉基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測的方法。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種快速檢測轉基因大豆MON89788的實時熒光PCR方法，使其檢測靈敏度達到0.1%，并且可以同時進行大批量樣品分析，能夠很好地適用于進出口和國內的轉基因大豆MON89788及其制品的監測需求。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種快速檢測轉基因大豆MON89788的實時熒光PCR方法，包括以下步驟：

1）制樣與DNA提取

取大豆或其加工產品的樣品，粉碎，用常規核酸提取方法提取DNA，確保DNA純度應符合PCR檢測要求；

2）實時熒光PCR

反應體系為25μL：2-5μL的DNA模板（100~200ng），12.5μL?LightCycler?480?Probes?Master（商品化TaqMan實時熒光定量PCR預混液（2×）中的一種），0.75μL引物MON89788-F（10μmol/L）、0.75μL引物MON89788-R（10μmol/L），0.5μL探針MON89788-P（10μmol/L），去離子水補齊體積；反應條件為：預變性95℃?10min；變性95℃?15s，退火延伸60℃?1min，45個循環；同時設置陰陽性對照與空白對照，陽性對照為質粒標準分子pMD19T-MON89788，陰性對照為非轉基因大豆基因組DNA，空白對照為無菌水；