[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310693528.7
• 申請(qǐng)日: 2013-12-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103725777A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃明;劉欣;祝長(zhǎng)青;黃繼超;周興虎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京佳邦食品有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

1.一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）制樣與DNA提取

取大豆或其加工產(chǎn)品的樣品，粉碎，用常規(guī)核酸提取方法提取DNA，確保DNA純度應(yīng)符合PCR檢測(cè)要求；

2）實(shí)時(shí)熒光PCR

反應(yīng)體系為25μL：2-5μL的DNA模板，12.5μL?LightCycler?480?Probes?Master，0.75μL引物MON89788-F、0.75μL引物MON89788-R，0.5μL探針MON89788-P，去離子水補(bǔ)齊體積；反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃?10min；變性95℃?15s，退火延伸60℃?1min，45個(gè)循環(huán)；同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-MON89788，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，空白對(duì)照為無(wú)菌水；

其中，引物與探針序?yàn)椋阂颩ON89788-F：5’-CGCTTCAATCGTGGTTATCA-3’，引物MON89788-R：5’-CGAGCAGGACCTGCAGAAG-3’；探針MON89788-P：FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA-BHQ1；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-MON89788為克隆有SEQ?ID?NO.3所示序列的質(zhì)粒；

3）結(jié)果判定

質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：空白對(duì)照無(wú)熒光增幅現(xiàn)象；陰性目標(biāo)DNA對(duì)照無(wú)熒光增幅現(xiàn)象；陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照檢測(cè)Ct值小于或等于34；如有一項(xiàng)不符合者，重復(fù)步驟1）和2）；

結(jié)果判斷：待測(cè)樣品Ct值大于或等于40，設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常者，則判定該樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆MON89788；待測(cè)樣品Ct值小于或等于36，設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常者，則判定該樣品檢出轉(zhuǎn)基因大豆MON89788；待測(cè)樣品Ct值在36～40之間，重復(fù)步驟2），再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于40，且設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出轉(zhuǎn)基因大豆MON89788；再次擴(kuò)增后結(jié)果Ct值大于40，且設(shè)置的對(duì)照結(jié)果正常，判定該樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆MON89788。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于，所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-MON89788構(gòu)建過(guò)程如下：

1）根據(jù)SEQ?ID?NO.1所示的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的品系特異性序列和SEQ?ID?NO.2所示的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列，基于PAS的方法，設(shè)計(jì)并合成出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的PCR引物，共計(jì)14條，具體如下：

引物A1：5’-CCTCCTCGGGAAAGTTACAACTCAA-3’；

引物A2：5’-CGAGGGTTTTGGGGTGCCGTTTTCGTCAACCTTATTGAGTTGTAACTTTCCCGA-3’；

引物A3：5’-AACGGCACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATC-3’；

引物A4：5’-GGCAACGCTACCGGTTTCTTTGTCCCAAATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAGGGC-3’；

引物A5：5’-AAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTAT-3’；

引物A6：5’-AAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’；

引物A7：5’-AAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTCGCACCAATTGACACTAAGCCA-3’；

引物A8：5’-GTTGAAAAGACCAAGATAACCTGCATGTGTTTGTGGCTTAGTGTCAATTGGTGC-3’；

引物A9：5’-GGTTATCTTGGTCTTTTCAACGAAAACGAGTCTGGTGATCAAGTCGTCGCTGTT-3’；

引物A10：5’-CCACGATTGAAGCGCTAGAGCGGGATCAAACTCAACAGCGACGACTTGATCACC-3’；

引物A11：5’-GCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTG-3’；

引物A12：5’-CTTGATGGGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTT-3’；

引物A13：5’-GACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCTTCT-3’；

引物A14：5’-TCGAGCAGGACCTGCAGAAGCTTGATAACGCGGCCG-3’；

2）將合成的14條引物分別稀釋至10pmol/μL，引物A2~A13各取10μL，混合均勻后再稀釋10倍作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：3μL引物A1，3μL引物A14，25μL?SapphireAmp?Fast?PCR?Master?Mix（2×），12μL模板，ddH₂O補(bǔ)足體積至50μL；PCR擴(kuò)增條件：95℃，1min；94℃，30s，50℃，35s，72℃，40s，30個(gè)循環(huán)；72℃，8min；得到大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin片段和轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的品系特異性片段連接在一起的重組DNA序列，長(zhǎng)437bp序列，序列如SEQ?ID?NO.3所示；

3）回收酶切后的重組DNA序列及質(zhì)粒載體pMD19-T，使用T4?DNA連接酶16℃過(guò)夜反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，篩選陽(yáng)性克隆；連接反應(yīng)體系為：0.5μL?pMD19-T載體，3.5μL重組DNA序列，1μL?T4?DNA?Ligase，1μL?10XT4?DNA?Ligase?Reaction?Buffer，ddH₂O補(bǔ)足體積至10μL；

4）按照AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-MON89788，測(cè)序驗(yàn)證；構(gòu)建出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD19T-MON89788，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子置-20℃保存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->