[發(fā)明專利]一種腦組織快速冰凍切片的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310693067.3
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103674677A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 高旭;彭亞會;惠洋;馬寧;周凌云
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N1/42
• 分類號: G01N1/42;G01N1/30
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

1.一種腦組織快速冰凍切片的制備方法，其特征在于依次包括樣本取材及凍存、冰凍切片的制作以及冰凍切片的HE染色、封片步驟，其中所述的樣本取材及凍存包括以下步驟：

（1）制備圓柱形無蓋錫紙盒，要求底面平整，用于裝冰凍包埋劑OCT；

（2）制備底面組織快速冰凍裝置，所述裝置中利用預冷丙酮隔開組織與液氮；

（3）將處死后的小鼠的腦組織取出，根據需要進行切面，厚度1.5-2.5毫米；

（4）將腦組織切面放入步驟（1）中裝有冰凍包埋劑OCT的錫紙盒的底部且靠近中間的位置，要求腦組織切面完全浸入OCT中，盡量減少氣泡；

（5）將步驟（4）的裝有腦組織切面的錫紙盒放入步驟（2）的預先裝有預冷丙酮的組織快速冰凍裝置，然后放入液氮中，且液氮表面不沒過組織快速冰凍裝置，30～50秒鐘待OCT包埋劑中心變白時取出組織快速冰凍裝置，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中所述的組織快速冰凍裝置包括手柄，所述手柄連接在外膽上，所述外膽內部設有內膽，所述外膽與內膽之間形成裝液體區(qū)域，所述外膽上端與內膽上端之間設有連接環(huán)，連接環(huán)將所述外膽與內膽之間形成的裝液體區(qū)域封閉，連接環(huán)上設有孔，在所述裝液體區(qū)域內加入預冷丙酮。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述外膽與內膽的距離為2厘米。

4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述孔上設有孔蓋。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，冰凍切片的制作包括以下步驟：

（1）切片前將權利要求1步驟（5）得到的OCT包埋的冰凍組織從-80℃冰箱移到-20℃冰箱中1-2個小時，再取出冰凍組織，將組織面朝上固定到凍臺上進行切片；

（2）腦組織的冰凍切片機在-17～18℃的切片溫度下進行切片，利用粘附載玻片進行直接貼片，切片厚度根據需要為4微米到10微米；

（3）將載有切片的粘附載玻片迅速利用-20℃冷丙酮固定5～10分鐘；

（4）固定后取出直接染色或晾干后利用-80℃冰箱保存待用。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，冰凍切片的HE染色、封片過程包括以下步驟：

（1）將固定后的切片取出水洗；

（2）利用蘇木素染色3～5分鐘；

（3）自來水洗，用濾紙吸干液體；

（4）1%的鹽酸酒精溶液分化10～20秒，此時切片由藍變紅；

（5）自來水洗返藍25-30分鐘，此時切片由紅變淺藍；

（6）95%乙醇洗1分鐘；

（7）0.5%伊紅染色40～60分鐘秒；

（8）自來水稍洗，用濾紙吸干液體；

（9）95%乙醇脫水2次，每次5分鐘，用濾紙吸干液體；

（10）100%乙醇脫水3次，每次5分鐘，用濾紙吸干液體；

（11）二甲苯透明2次，每次5分鐘；

（12）中性樹膠封片。