[發明專利]一種腦組織快速冰凍切片的制備方法

有效

• 申請號: 201310693067.3
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103674677A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 高旭;彭亞會;惠洋;馬寧;周凌云
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: G01N1/42
• 分類號: G01N1/42;G01N1/30
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種生物醫學領域，具體涉及建立一種腦組織快速冰凍切片的制備方法，也是建立一種關于疾病的快速病理診斷的方法。?

背景技術

冰凍切片是借助于低溫條件使組織達到一定的硬度然后切片的一種方法，由于它不需要經過長時間的固定、包埋和切片后處理等步驟，而且能很好的保存組織的抗原和酶的活性，因而被廣泛應用于臨床快速病理診斷以及對于疾病的科學研究上。由于冰凍切片的質量直接影響到病理診斷的準確性，因此制備高質量的冰凍切片具有重要意義。但是冰凍切片比一般石蠟制片要求高、難度大，科研實驗中冰凍切片、免疫組化及免疫熒光實驗比臨床病理診斷的要求更高。?

基于影響冰凍切片制作質量的因素較多，主要因素有取材、切片時的溫度以及切片后的固定、儲存。其中樣本的樣品的取材及凍存方法至關重要。只有冷凍適宜組織塊切片程度時迅速切片才能切出完好的切片。取材過程中要針對容易形成冰晶這一問題采取不同措施避免冰晶的形成。?

冰凍切片是免疫組織化學中最常用的切片方法。目前，實驗室中冰凍切片的處理方法主要有兩種。方法一：利用灌注固定液通過左心室進行灌注，以全身僵硬為準，灌注后立即切取組織塊，并快速投入后固定液中進行后固定，固定后再利用10%蔗糖，20%蔗糖，30%蔗糖（0.1MPBS溶）進行梯度脫水置換，每個梯度的蔗糖一般在室溫條件下4小時到過夜，最后以組織塊沉下為準。雖然此方法能夠很好的保護好組織形態，但灌注后的其他組織不能用于留存核酸及蛋白等的分子及生化指標的檢測，因此有一定的局限性。方法二：實驗動物處死后直接冰凍組織，利用OCT包埋后放于液氮液面冷凍至包埋劑中心即將變白時取出，然后立即放于-80℃冰箱保存備用切片。不經過灌注的動物組織可以根據需要進行分子及生化指標的留樣分析，但是，由于液氮的熔點低，利用液氮直接速凍的方法容易將組織凍裂。?

基于以上分析以及丙酮的熔點為-96℃，因此利用丙酮作為隔開組織和液氮以防將組織直接放于液氮中速凍凍裂，同時，丙酮還是很好的固定液，能夠很好的保護好抗原。另外，不經過灌注處理的組織還可以留為其他指標的檢測。?

發明內容

本發明的目的在于建立一種腦組織快速冰凍切片的制備方法，該方法實施方便、簡捷、制片完整，減少冰晶，具有可重復性及可適用性，利于后期臨床診斷及疾病的研發工作。?

為了達到本發明的目的，本發明所采用的技術手段為：?

本發明的一種腦組織快速冰凍切片的制備方法，其特征在于依次包括樣本取材及凍存、冰凍切片的制作以及冰凍切片的HE染色、封片步驟，其中所述的樣本取材及凍存包括以下步驟：?

（1）制備圓柱形無蓋錫紙盒，要求底面平整，用于裝冰凍包埋劑OCT；?

（2）制備底面組織快速冰凍裝置，所述裝置中利用預冷丙酮隔開組織與液氮；?

（3）將處死后的小鼠的腦組織取出，根據需要進行切面，厚度1.5-2.5毫米；?

（4）將腦組織切面放入步驟（1）中裝有冰凍包埋劑OCT的錫紙盒的底部且靠近中間的位置，要求腦組織切面完全浸入OCT中，盡量減少氣泡；?

（5）將步驟（4）的裝有腦組織切面的錫紙盒放入步驟（2）的預先裝有預冷丙酮的組織快速冰凍裝置，然后放入液氮中，且液氮表面不沒過組織快速冰凍裝置，30～50秒鐘待OCT包埋劑中心變白時取出組織快速冰凍裝置，放入-80℃冰箱保存備用。?

在本發明的一個具體實施例中，步驟（2）中所述的組織快速冰凍裝置包括手柄，所述手柄連接在外膽上，所述外膽內部設有內膽，所述外膽與內膽之間形成裝液體區域，所述外膽上端與內膽上端之間設有連接環，連接環將所述外膽與內膽之間形成的裝液體區域封閉，連接環上設有孔，在所述裝液體區域內加入預冷丙酮。優選的，所述外膽與內膽的距離為2厘米，更優選的，所述孔上設有孔蓋以防止丙酮揮發。?

在本發明中，優選的，所述的冰凍切片的制作包括以下步驟：?

（1）切片前將權利要求1步驟（5）得到的OCT包埋的冰凍組織從-80℃冰箱移到-20℃冰箱中1-2個小時，再取出冰凍組織，將組織面朝上固定到凍臺上進行切片；?

（2）腦組織的冰凍切片機在17～18℃的切片溫度下進行切片，利用粘附載玻片進行直接貼片，切片厚度根據需要為4微米到10微米；?

（3）將載有切片的粘附載玻片迅速利用-20℃冷丙酮固定5～10分鐘；?

（4）固定后取出直接染色或晾干后利用-80℃冰箱保存待用。?

在本發明中，優選的，所述的冰凍切片的HE染色、封片過程包括以下步驟：?