[發明專利]NK細胞體外培養方法

有效

• 申請號: 201310691566.9
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103627672A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 任秀寶;于津浦
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

技術領域

本發明涉及人類細胞的培養，具體是一種NK細胞體外培養方法。

背景技術

自然殺傷細胞(natural?killer?cell，NK)是機體重要的免疫細胞，是機體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線，不僅與抗腫瘤、?抗病毒感染和免疫調節有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。在殺傷靶細胞的過程中，NK細胞可以非特異性識別靶細胞，并且不受主要組織相容性復合體(major?histocompatibility?complex,?MHC)的限制，對多種腫瘤細胞有迅速殺傷和溶解作用。但是正常人體外周血中的NK細胞數量較少，僅占外周血淋巴細胞的10%~20%。因此，獲得高質量高純度的NK細胞成為其臨床應用最為關鍵的問題之一。目前，隨著生物治療臨床應用的廣泛開展，NK細胞治療取得了一定的臨床療效。據報道，多種細胞因子組合被廣泛應用于NK細胞的體外培養。已知許多細胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-18?等單獨或組合均能有效地誘導、刺激特定的NK?細胞增殖和促進其分化成熟，其中IL-2?和IL-15的作用尤為明顯。

研究發現，骨髓CD34+造血干/祖細胞并無抗人白血病K562細胞增殖的能力，只有經過IL-2等細胞因子誘導刺激培養后，CD34+細胞定向分化為CD3-CD56+的NK細胞群才可抑制K562細胞增殖。IL-2具有激活NK細胞、促進NK細胞增殖分化和細胞因子的產生，通過細胞接觸的方式來抑制K562細胞的增殖的特性。IL-15不僅可以上調NK細胞表面的活化性受體，如CD16和NKG2D,產生大量的IFN-γ，還可以誘導骨髓CD34+的淋巴細胞分化為NK細胞。IL-2和IL-15聯合應用還可以誘導產生白細胞功能相關抗原-1（lymphocyte?function-associated?antigen-1，LFA-1）,參與效靶細胞結合。

赫賽?。℉erceptin）是針對HER-2受體的人源化的單克隆抗體，可以與HER-2受體細胞外區域特異性結合，展現出顯著的抗腫瘤效應，因而目前被廣泛應用到HER-2過表達的乳腺癌患者的臨床治療。

發明內容

本發明就是為了解決現有技術中NK細胞體外大規模培養的問題，而提供一種NK細胞體外培養方法。

本發明系采用單克隆抗體聯合細胞因子的方法，在保證NK細胞體外擴增倍數、細胞比例的前提下，提高擴增產物的殺傷活性。

本發明是按照以下技術方案實現的。

一種NK細胞體外培養方法，該方法是按照以下步驟進行的：

a.用PBS稀釋Herceptin至濃度0.85-1.05mg/ml，取910μl；用PBS稀釋人免疫球蛋白至濃度1-2mg/ml，取400μl，合并后再用PBS補齊至20ml，均勻鋪滿培養瓶瓶底，密封置于4℃冰箱中過夜，次日取出，將液體倒出，用PBS洗2遍；

b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法進行密度梯度離心,?離心速度為350×g，離心時間為15-20分鐘，吸取中間界面層的單個核細胞，用PBS洗滌3次，加入無血清培養基，調整細胞濃度為1.0×10⁶/ml-3.0×10⁶/ml；然后加入細胞因子IL-2至終濃度10ng/ml，IL-15至終濃度50ng/ml，加入到已經用Herceptin包被的培養瓶中，37℃，5%?CO₂孵箱中連續培養15天，每3天補加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的無血清培養基一次，補液量與補液前液體量相同，即補液后體積為補液前的2倍。

這樣設計的本發明可以高效、安全的進行NK細胞體外大規模培養。由于加入Herceptin，在保證各個細胞亞群擴增倍數的基礎上，又增強了淋巴細胞的殺傷活性；無血清培養基可替代含血清的完全培養基，二者所得培養產物的數目和細胞活性相當，而且無血清培養基用于NK細胞的臨床生物治療，可以增加其臨床應用的安全性；細胞因子IL－2聯合IL－15可以促進NK細胞的生長和增殖，可提高活化免疫細胞的殺傷活性。并分別從細胞擴增倍數、細胞表型以及細胞表面活化受體的表達等方面來檢測擴增產物的殺瘤活性。

附圖說明

圖1是擴增產物的擴增倍數的對比圖；

圖2是擴增產物的細胞表型的對比圖；

圖3是擴增產物的殺傷活性對比圖；

圖4是擴增產物NK細胞表面活化受體表達對比圖；

圖5是擴增產物NKT細胞表面活化受體表達對比圖；

圖6是擴增產物T細胞表面活化受體表達對比圖。