[發明專利]一種氧連接氮乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修飾糖蛋白質及糖肽的化學衍生方法

在審

• 申請號: 201310691220.9
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN104713754A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 張麗華;夏思敏;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及氧連接氮乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修飾糖蛋白質及糖肽的化學衍生。具體地說是利用高碘酸鈉氧化修飾的氮乙酰葡糖胺形成醛基，利用吉拉德試劑上的酰阱基團使該類糖蛋白質及糖肽衍生上季銨鹽基團。?

背景技術

氧連接氮乙酰葡糖胺修飾是一種發生在蛋白質絲氨酸及蘇氨酸殘基上的翻譯后修飾，是一種真核細胞內重要的單糖翻譯后修飾，在細胞內信號通路中扮演重要作用。然而，該種翻譯后修飾的糖蛋白糖蛋白質的研究與其他糖蛋白質研究面臨相同的難點：豐度低、糖肽占總肽段比例小，易被高豐度的非糖肽掩蓋，質譜信號響應低等。另外作為單糖修飾它也具有其獨有的研究難點：修飾基團小，對整體修飾糖蛋白或糖肽的理化性質影響小，無法使用其他糖蛋白的富集手段以降低非修飾蛋白質的干擾。?

文獻報道中對該種糖蛋白質常用的研究方法主要有酶促衍生富集法和凝集素親和法。另外最近有文獻（Journal?of?Proteome?Research?2010,9,2200–2206）報道了一種利用高碘酸鈉氧化氮乙酰葡糖胺形成醛基，利用酰阱凝膠富集研究該種糖蛋白的工作，該工作開發了利用化學手段研究氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質的手段，相較昂貴的酶促衍?生手段，為廉價大規模研究氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質提供可能。?

在蛋白質或肽段上衍生上季銨鹽基團在增強樣品質譜信號，改變樣品電荷等方面有著廣泛的應用。因此，鑒于氧連接氮乙酰葡糖胺的修飾會抑制蛋白及肽的質譜響應信號，我們通過季銨鹽基團的修飾能有效地提高質譜信號，為后續的質譜分析研究提供幫助。同時由于非修飾蛋白及肽段的干擾，季銨鹽基團的加入改變了該種糖蛋白質及肽段的電荷性質。?

發明內容

衍生上季銨鹽基團能夠增強樣品質譜信號，改變樣品電荷。本發明的目的是提供一種氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質及糖肽的化學衍生上季銨鹽基團，從而提高該糖蛋白質及糖肽質譜信號，改善其離子交換色譜分離能力。?

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：?

以高碘酸鈉作氧化劑，對修飾的氮乙酰葡糖胺基團上的鄰位羥基進行開環反應形成兩個醛基基團，利用吉拉德試劑上的酰阱和新生成的醛基反應，從而糖蛋白質及糖肽化學衍生上季銨鹽基團。?

所述氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質及糖肽的化學衍生方法，具體步驟如下：?

（1）氮乙酰葡糖胺基團氧化：在pH=5-6的30-100mM乙酸鈉緩沖溶液中，氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質或糖肽樣品與濃度為20-30mM高碘酸鈉溶液反應；反應溫度35-40℃，反應時間4-8小時。氧化反應結束后，加入4-6倍于高碘酸鈉摩爾量亞硫酸鈉，反應?10-40分鐘，終止氧化反應。對于糖肽而言，采用甲醛二甲基化方法封閉N末端氨基，每100μg肽段加入1-4%甲醛溶液10-25μl，0.15-0.6mM氰基硼氫化鈉10-25μl，反應0.5-2小時，反相除鹽去除甲醛和氰基硼氫化鈉。?

（2）吉拉德試劑衍生反應：將經過高碘酸鈉氧化的糖蛋白質樣品于濃度為10-100mM的吉拉德試劑混合，反應1-6小時。反應過程在pH=5-6的30-100mM乙酸鈉溶液中進行。?

（3）采用反相液相色譜分離除去未反應吉拉德試劑：采用反相C18或C8色譜住，流動相A：2%乙腈，98%水及0.1%三氟乙酸。流動相B：98%乙腈，2%水及0.1%三氟乙酸。采用2%流動相B上樣，之后用上樣緩沖液沖洗色譜柱5-15分鐘，之后用80%流動相將糖蛋白質或糖肽樣品洗脫下來，冷凍干燥。?

衍生后的樣品用于后續色譜分析及質譜分析。?

本發明具有如下優點：?

1.本發明在氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質及糖肽上衍生季銨鹽基團，增強樣品質譜信號，改善分離能力。?

2.本發明采用酰肼和醛基的反應，反應效率高，副反應少。?

3.本發明衍生的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質及糖肽，保留了部分原氮乙酰葡糖胺的基團，為后續質譜解譜分析提供信息。?

4.本發明利用化學方法衍生的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質及糖肽，更加廉價，有利于大量大規模樣品分析。?

附圖說明

圖1氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質及糖肽化學衍生流程圖?

圖2氧連接氮乙酰葡糖胺修飾標肽TAPTSgTIAPG衍生后MALDI質譜?

圖3標肽TAPTSgTIAPG衍生前后質譜信號增強幅度比較圖a)MALDI衍生肽段與未衍生肽段1：5混合。b)LTQ衍生肽段與未衍生肽段1：1混合?

具體實施方式