[發明專利]一種提取海洋微藻油體的蛋白的方法

在審

• 申請號: 201310691217.7
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN104710520A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 薛松;申培麗;曹旭鵬;吳霜
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K14/405
• 分類號: C07K14/405;C07K1/30
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明屬于海洋生物技術領域，具體為通過分離純化微藻油體及油體相關蛋白，對微藻油脂代謝，油體膜生物合成，膜運輸和信號轉導機理進行研究。?

背景技術

隨著化石能源的日趨枯竭和生態環境的日漸惡化,可再生且清潔的生物能源的研究開發已成為近年來的熱點話題，海洋微藻具有種類多、固定CO₂光合作用效率高、生物產量高、生長周期短及自身油脂含量高、不占耕地、易于人工控制等優點，被認為是制備生物柴油最佳的生物質能源原料之一。微藻積累大量油脂以甘油酸三酯（triacylglyeerols,TAG）的結構貯存在胞漿油體中，油體外部包被一層磷脂單分子層，以及鑲嵌其中或附著其上的油體相關蛋白質。這些蛋白或是油體結構蛋白，或是其它發揮生物學功能蛋白，在油體形成、穩定以及油脂代謝利用過程中起著關鍵作用。?

目前在多種生物體中中已經發現并解析了油體相關蛋白，在動物和真菌中分離得到油體相關蛋白屬于PAT家族，如Perilipin、ADRP、TIP47等；植物油因其特殊營養貯存形式也被選作過生物柴油原料，種子植物油體研究日漸成熟，油體成分主要是甘油酸三酯TAG，磷脂PL和油體相關蛋白。內部液態基質為TAG，外圍包裹一層磷脂單分子層，磷脂疏水基團與TAG相互作用，親水基團暴露在油體外層，油體表面親水。組成膜的蛋白質主要是油體蛋白Oleosins，有保守區域：Pro-knot?motif，中間72個連續非極性殘基包括三個pro殘基和一個ser殘基，PX₅SPX₃P。后來也發現短鏈殘基Oleolike，二者在維持油體穩定性方面發揮重大作用，隨后的Caleosin、Steroleosin也被發現。Oleosin保守區域在JGI/NCBI中查找，發現沒有能編碼oleosin不等鞭毛藻-棕藻/金藻/硅藻/卵藻以及等鞭毛藻；Oleolike在綠藻中有，MLDP（major?LD?protein）則在微藻中普遍存在。?

提取微藻油體，進而純化油體相關蛋白，通過解析油體蛋白質生理生化特性，研究磷脂膜蛋白結構功能，闡明微藻在脅迫條件下積累油體過程，油脂代謝和油體變化機制，深入了解微藻產油機理，改良微藻品種，提高油脂含量和油脂組分，為更好利用第三代生物能源海洋微藻提供理論基礎。?

發明內容

本發明目的是提供一種提取純化微藻油體及其相關蛋白的方法。?為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：?

一種提取微藻油體的蛋白的方法：?

（1）利用高壓、超聲、研磨或高滲破碎藻細胞后，油體因其密度低與其它亞細胞器經超速離心后分離，油體浮在所有水相梯度頂層，收集油層，洗滌，具體為分離緩沖液中加入0.6-1.0M蔗糖，保護胞內細胞器，利用高弗式壓碎器15000-20000psi破碎微藻細胞，選擇蔗糖梯度、離心速率或離心力，油體直徑在0.5-5um之間，收集頂層油體，洗滌；?

（2）將油脂和蛋白分離，用氯仿：甲醇（V/V1:2）或2-4倍體積冷丙酮12-20h,-20℃處理油體，離心，收集油相和沉淀；0.1%SDS復溶沉淀蛋白，凍干，即可得到目的蛋白。?

利用研磨（Beads?shocker/Beadbeater）破碎微藻細胞，顯微鏡觀察藻細胞破碎情況，測破碎后上清蛋白濃度，計算破碎率。?

利用超聲破碎微藻細胞，功率在3-100w,超聲5s,間隔1-5s,超聲1-5min。?

利用高滲破碎微藻細胞，將耐鹽微藻從高鹽營養液中轉移到無鹽緩沖液中，溫和破碎且不破碎其它亞細胞器，然后再利用密度梯度離心分離純化油體。?

分離緩沖液可以用0.15M?tricine-KOH緩沖液或25-50mMHEPES-KOH緩沖液或10-20mM?MOPS或PBS或Tris-HCl緩沖液，pH在7.0-8.0之間；緩沖液中加入KCl、MgCl2、EDTA、EGTA、DTT,高濃度蔗糖以及PMSF或Cocktail蛋白酶抑制劑。?

蔗糖梯度為1.0M、0.6M、0.4M、0.2M、0M或30%、20%、10%、5%、0；離心力在10,000g-150,000g；離心時間30min-2h?

步驟（1）整個過程在4℃條件下進行。?