[發明專利]一種微藻藻株人工選育方法

在審

• 申請號: 201310691127.8
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN104711249A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 薛松;艾江寧;曹旭鵬
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;C12R1/89
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本專利屬于微藻培養技術領域（C12N1/12），是一種微藻藻株人工選育方法。

背景技術

微藻為自養型微生物，因其細胞內存在光合作用系統也稱為微藻植物。微藻具有高效吸收太陽能、固定二氧化碳產生生物質的能力（即光合作用能力）；同時微藻作為微生物的一種，其增殖速度較快。作為單細胞生物，微藻的主要組成為蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已經是重要的養殖餌料被養殖企業廣泛應用，同時微藻也已經成為類胡蘿卜素、蛋白質、多糖等保健食品的來源。隨著化石能源枯竭的預期加劇，微藻在能源制品和精細化學品的潛在應用也得到了極大關注。

目前，實際生產應用的藻種多從自然界直接分離獲得，后代的性狀單一，容易出現對環境的適應能力差以及藻種退化等問題。以傳統的方法進行藻種的復壯或重新選育優良藻株，往往需要較長的周期和花費大量的人力。為了獲得高產及滿足下游煉制需求的藻株，必須改進微藻的育種技術，從而對微藻的種質進行改良。

常壓室溫等離子體（ARTP）是近幾年來發展起來的一種新的等離子體源，能夠在常壓(1am)下產生溫度在25～40℃之間的、具有高活性粒子（如處于激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流。科學研究表明，等離子體中適當劑量的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細胞壁/膜的結構及通透性改變，并引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網絡顯著變化，最終導致微生物產生致畸突變。

常規微藻藻株篩選也是一個耗時較長的工作，因為大多檢測方法都是基于獲得一定生物量基礎上開展的。如，常規的微藻油脂評估至少需要數百毫升微藻藻液，從固體平板至所需要生物量平均需要一個月的培養時間。而同時，誘變篩選可能獲得上百個備選藻株，因此，適宜的誘變后篩選技術也是微藻藻株選育的重要一環。

隨著各種染色方法靈敏度的提高，利用染色法對微藻生物質進行評估需要生物量大大少于常規方法，為提高篩選提供了可能，如，碘液可以對細胞內的淀粉進行染色，以熒光染料尼羅紅可以對細胞內的中性脂進行染色等。

因此，基于上述分析，本發明提出了一種新型微藻藻株人工選育方法，將等離子體誘變與基于染色的快速篩選相結合，具有高效、快速獲得目標藻株的特點。

發明內容

本發明的目的是提供一種微藻藻株人工選育方法。

野生藻株的馴化和改良是微藻工業化生產實現所必需的，為了提高微藻藻株選育的速度，本發明結合了綠色無污染的常壓室溫等離子體誘變、基于吸光度與特異性熒光染料熒光強度變化的藻株篩選技術，實現目標藻株高效、快速獲得的目的。

本發明利用常壓室溫等離子體對野生藻株進行誘變，即使用室溫常壓等離子體儀對微藻培養液進行誘變。其中待誘變微藻細胞濃度在100-1000萬細胞/毫升，誘變微藻藻液在10～200μL，電源輸出功率為50～200W，工作氣流量為1～20SLM，等離子體發射源與樣品之間距離為1～10mm，放電時間5秒～2分鐘。

所述誘變操作結束后，將誘變處理后的微藻涂布于固體培養基上，在選擇壓力（溫度、光強、缺陷培養基）或正常培養條件下進行培養，同時以未誘變處理的藻液作為對照。誘變成功的判定標準：對于正常培養條件下，至藻落生長出后，分別對誘變和對照組進行藻落計數，以致死率=（1-誘變藻落數/對照藻落數）×100%大于或等于90%為成功誘變的指標，對生長出誘變藻落進行96孔板培養篩選；對于選擇壓力下，生長出的藻落即用于96孔板培養篩選。

所述藻落在96孔板中進行液體培養，利用酶標儀或者具有孔板掃描功能的分光光度計對孔板培養的微藻OD值進行測定，獲得藻細胞生長情況。根據不同微藻藻株可選用不同的檢測波長，如金藻通常使用650～680nm檢測，綠藻通常使用750nm檢測。

所述液體培養微藻通過特異性染色劑進行染色，以顯色強弱對目標代謝物生產情況進行檢測。通常利用碘液對細胞內淀粉進行染色，以熒光染料尼羅紅或者BODIPY對細胞內中性脂或者油脂進行染色。

最終，根據篩選目的，結合生長于代謝物生產情況，確定對應的誘變藻株，用于后續研究或生產實踐。

本發明是在室溫、大氣壓、低電壓環境下使用等離子體對微藻進行誘變，避免了常規物理化學誘變方法的毒性或強細胞損傷，同時處理時間短，誘變處理過程僅有幾分鐘；利用96孔板培養作為篩選基礎，將OD檢測與特異性顯色反應結合，避免了常規檢測過程中需要較長培養時間以獲得足量生物質的弊端，同時可對大量藻株進行測定，從藻落到初步篩選出目標藻株的時間縮短至一周左右。因此本發明相對常規微藻藻株選育是一種綠色、高效、快速的新方法。