[發明專利]鑒別馬皰疹病毒1/4型的Lamp檢測引物及方法

無效

• 申請號: 201310690472.X
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103757131A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 曲娟娟;胡曉亮;于敏
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及馬皰疹病毒的Lamp引物及其快速檢測方法，具體涉及馬皰疹病毒1/4型分型檢測和鑒定，屬于動物病毒病檢測、鑒定及防治領域。

背景技術

馬皰疹病毒1型（EHV-1）和馬皰疹病毒4型（EHV-4）是引起馬鼻肺炎（Equine?rhinopneumonitis,?ER）的親緣關系密切的兩種α-皰疹病毒（alphaherpesvirus）。EHV-1除了引起呼吸道疾病外，主要可致使妊娠母馬發生流產，以及偶爾引起馬的神經系統疾病；EHV-4主要導致呼吸道癥狀，偶爾也可引起妊娠母馬的流產。EHV-1/4在遺傳、抗原性、致病性上密切相關，有許多共同的流行病學、臨床和病理特征，?1981年以前一直將其稱為EHV1亞型1以及亞型2。序列分析資料也證實，這兩個型病毒的基因組既密切相關又有不同程度的差異，由于兩種類型病毒存在著廣泛的抗原交叉反應性，難以從血清學角度對二者進行區分，既不利于對該病的調查研究，也不利于防控措施的制定。因此尋找一種能夠區分二者的分子生物學診斷方法對預防及控制馬鼻肺炎具有重要的現實意義。目前EHV的分子生物學檢測主要是常規PCR方法,此方法不但需要昂貴的儀器及而且檢測時間較長，且分型效果并不理想。

2000年由日本榮研化學株式會社開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，環介導等溫擴增反應（Lamp），其特點是針對靶基因的6個或者8個區域設計4個或者6個特意引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件在63℃左右保溫30-90分鐘，即可完成核酸擴增反應。該方法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環等過程，反應結果既可以利用肉眼觀察顏色的變化或瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶的有無來判定。具有操作簡便、快速、特異性強等特點。本發明根據GenBank公布的EHV1和EHV4的gB基因核酸序列，設計馬皰疹病毒1/4型的Lamp引物，建立了EHV1/4的Lamp分型檢測方法。本發明所建立的分型Lamp檢測方法能夠在核酸水平區分EHV1和EHV4型，該方法的建立為馬皰疹病毒的快速診斷和分型檢測提供了參考依據，對馬鼻肺炎的監測及防控具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是針對馬皰疹病毒1型和4型分型鑒定的問題，提供一種簡便、快速、特異性強、操作簡單、結果易于判定的馬皰疹病毒核酸分型的Lamp檢測方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的；

1.引物的設計

根據馬皰疹病毒1型和4型馬皰疹病毒序列進行比對，選取gB區段進行引物設計。利用在線軟件Primer?Explorer?V4software(http://primerexplorer.jp)設計Lamp引物（包括外引物和內引物）見表1。檢測EHV1環介導等溫擴增反應引物，由一對外引物和一對內引物組成，其中外引物由EHV1FIP和EHV1BIP組成；內引物由EHV1F3和EHV1B3組成；檢測EHV4環介導等溫擴增反應引物，由一對外引物和一對內引物組成，其中外引物由EHV4FIP和EHV4BIP組成；內引物由EHV4F3和EHV4B3組成。

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表1?檢測馬皰疹病毒1/4的Lamp引物的名稱和序列

2.病毒細胞的培養

將長成單層的馬皮膚細胞分別接種EHV1(438/77)和EHV4(405/76)毒?株（美國模式菌種收集中心購買），加入含40?ml/L胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM生長液適量，37℃靜置培養。待細胞病變（CPE）達85%以上即可收獲病毒，并反復凍融3次。取適量病毒懸液于8000×g離心30min，收集上清液；然后將收集的上清液以10⁵ｇ離心3h，收集的沉淀用1mL的1×PBS懸起；將預先制備好的200,400,600g/L?的蔗糖溶液按照體積比2:1:1?的比例加入離心管中，最后將收集的沉淀懸液緩慢加到液面上方，動作要緩慢。以10⁵ｇ離心3h，收集在400g/L和600g/L蔗糖層之間的沉淀。將沉淀用適量1×PBS懸起，用1×PBS進行脫糖，10⁵ｇ離心3h，獲得的沉淀即為純化的病毒。將病毒溶于1.5?mL?的1×PBS中，-20℃保存備用。

3．?病毒DNA的提取