[發(fā)明專利]大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標及其LAMP引物組合物和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310686657.3
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103710440A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 鄭小波;沈浩;戴婷婷;王源超;張海峰
• 申請（專利權）人: 南京農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及大豆擬莖點種腐病菌的檢測靶標及其PCR引物組合物和應用。?

背景技術

大豆南方莖潰瘍[Diaporthephaseolorum(Cke.&Ell.)Sacc.var.meridionalis?Morgan-Jones(簡稱DPM)]是我國重點關注的大豆上13種檢疫性病原菌之一^[1]。該病害于1973年在美國首次報道，20世紀80年代在美國廣泛傳播，已遍及美國南部各省，某地區(qū)損失高達100%，目前分布在巴西、玻利維亞、巴拉圭、美國和阿根廷，并且疫區(qū)還在不斷擴大，是國外大豆生產(chǎn)上重要病害，經(jīng)濟影響很大^[2,3]。?

目前，我國尚沒有DPM發(fā)生危害的報道。該病菌可通過種子和病殘體遠距離傳播，并且抗逆性很強，病殘體在-15℃～-18℃下可存活14個月。中國大豆產(chǎn)區(qū)具有和疫區(qū)類似的氣候條件，一旦傳入我國大豆產(chǎn)區(qū)，將對我國的大豆生產(chǎn)產(chǎn)生嚴重影響。?

因其近年來在國外發(fā)生普遍、經(jīng)濟影響大、傳入風險高且在我國尚未有發(fā)生的報道。為了阻止大豆南方莖潰瘍病菌傳播范圍的不斷擴大，使大豆南方莖潰瘍得到控制，需要對其進行快速、準確地檢測。?

環(huán)介導等溫擴增法（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP），是有日本的榮研株式會社的Notomi等人于2000年開發(fā)的一種新型的核酸擴增方法^[4]，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異性引物，在鏈置換DNA酶（Bst?DNA?polymerase）的作用下，60～65℃恒溫擴增，15～60min即可觀察結果，效率可達10⁹～10¹⁰個數(shù)量級，具有操作簡單、特異性強、產(chǎn)物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核酸三磷酸基質（dNTPs）中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子反應，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色。因此，可以把渾濁度作為反應的指標，只用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。由于LAMP反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，反應產(chǎn)物可通過是否形成白色沉淀（渾濁）或SYBR?GREEN?Ⅰ染色后的顏色變化來判斷是否反應。隨著技術的不斷完善和發(fā)展，會在食品檢測臨床疾病診斷等領域有著廣泛的應用前景^[5,6]。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef1-α。?

本發(fā)明的另一目的是提供該大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef1-α的其特異性LAMP引物組合物。?

本發(fā)明的又一目的是提供該大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef1-α及其特異性LAMP引物組合物的應用。?

本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：?

大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef1-α，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

所述的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef1在檢測或鑒定大豆南方莖潰瘍病菌中的應用。?

針對所述的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef設計的特異性LAMP引物組合物，其特征在于包括正向內引物FIP如SEQ?ID?NO.2所示，反向內引物BIP如SEQ?ID?NO.3所示，正向外引物F3如SEQ?ID?NO.4所示，反向外引物B3如SEQ?ID?NO.5所示。?

所述的針對所述的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef1-α設計的特異性LAMP引物組合物在檢測或鑒定大豆南方莖潰瘍病菌中的應用。?

一種用于檢測大大豆南方莖潰瘍病菌的LAMP檢測試劑盒，包含所述的特異性的LAMP引物組合物。?

所述的用于檢測大豆南方莖潰瘍病菌的LAMP檢測試劑盒，包含：由20mM正向內引物FIP、20mM反向內引物BIP，10mM正向外引物F3、10mM反向外引物B3，10%10xThermoPol?Reaction?Buffer、50mM?MgSO₄、10mMdNTP?Mixture、5M甜菜堿、8000U/mLBst?DNA?Polymerase?Large?fragment及超純水組成的檢測溶液。?