[發(fā)明專利]一種體外擴增γδT細胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201310684682.8
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103756962A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 解尚云;葉永清;譚令兵
• 申請（專利權）人: 上海柯萊遜生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 上海三方專利事務所 31127
• 代理人: 吳干權;錢品興

[技術領域]

本發(fā)明涉及γδT細胞培養(yǎng)方法，具體涉及一種體外擴增γδT細胞的方法。

[背景技術]

根據(jù)T細胞表面受體（TCR）的不同可將T淋巴細胞分為兩種：αβT淋巴細胞和γδT淋巴細胞。在人體中，αβT淋巴細胞是參與免疫應答的主要細胞群，占成熟T細胞的90～95%，而γδΤ細胞僅占外周血T淋巴細胞的0.5%-5%，但γδΤ細胞是先于αβΤ細胞出現(xiàn)的，主要分布于皮膚，小腸、食道、肺和生殖器官等上皮組織內。γδT細胞屬于機體的第一線防御細胞，在抗微生物感染免疫，尤其是在皮膚黏膜表面的免疫防御功能中，以及抗分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，γδT細胞具有無MHC限制性的殺瘤作用，對多種自體、同種異體或異種腫瘤細胞均表現(xiàn)出顯著的殺傷活性，因此，γδT細胞作為一類重要的腫瘤過繼免疫治療的候選細胞正在引起越來越多國內外學者的關注。但是另一方面，由于γδT細胞在人體中所含比例較低，分離純化到大量的γδT細胞較為困難，因而限制了其臨床使用。因此γδT細胞體外高效擴增是解決這一問題的主要方法。

在這一領域，人們做了很多有益的嘗試，國內在體外培養(yǎng)擴增γδΤ細胞通常采用IPP和IL-2共刺激法，但因費用相對昂貴且擴增倍數(shù)不足而未被廣泛使用。

因此，為了克服現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的γδT細胞的方法，該方法操作簡便，價格便宜，擴增γδΤ細胞效率高。

[發(fā)明內容]

本發(fā)明的目的是提供一種體外高效擴增γδT細胞的方法，提高γδT細胞的純度和殺傷活性，使γδT細胞更適用于臨床。

為實現(xiàn)上述目的，設計一種體外擴增γδT細胞的方法，

用抗TCRγδ抗體和CD28McAb預先包被T75培養(yǎng)瓶以備用；

將外周血單個核細胞轉入包被的T75培養(yǎng)瓶中，加入含有濃度為1.00μg/ml～3.87μg/ml的唑來膦酸、10μg/ml～50μg/ml的HSP70、0.1μg/ml～10μg/ml的TLR7配體、0.1μg/ml～5.0μg/ml的左旋咪唑、10ng/ml的IL-7、50ng/ml的IL-15和1000IU/ml的IL-2的無血清培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16天后獲得大量較高純度的γδT細胞。

上述方法還具有如下優(yōu)化方案：

所述唑來膦酸在無血清培養(yǎng)基中的濃度為1.29μg/ml。

所述HSP70在無血清培養(yǎng)基中的濃度為20μg/ml。

所述TLR7配體的濃度為1.0μg/ml。

所述LMS的濃度為0.5μg/ml。

本發(fā)明提供了一種新的γδT細胞的體外培養(yǎng)方法，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，本方法的優(yōu)越之處有以下幾點：

（1）采用抗TCRγδ抗體和CD28McAb兩種抗體包被，抗TCRγδ抗體提供了γδT細胞活化的第一信號，CD28McAb則為γδT細胞的活化提供了共刺激信號，使靜息的γδT細胞得到充分的激活；

（2）TCRγδ具有龐大的序列多態(tài)性，目前已有兩類分子被證實是TCRγδ配體：含磷酸基的非肽類小分子和熱休克蛋白；用IPP刺激γδΤ細胞時所需濃度較高，加之IPP的價格昂貴，如果培養(yǎng)至臨床所需要的細胞數(shù)量則培養(yǎng)成本較高，而唑來膦酸(Zoledronat)可以在較低的濃度下激活γδΤ細胞，所以選擇使用合適濃度的Zoledrona來刺激γδΤ細胞，使其大規(guī)模培養(yǎng)成為可能；HSP70不僅能攜帶特異性腫瘤抗原，還可作為抗原呈遞分子直接將抗原肽呈遞給γδΤ細胞，使其活化增殖，發(fā)揮細胞毒和分泌細胞因子的雙重功能；

（3）佐劑的應用。

Toll樣受體(TLRs)是非特異性免疫系統(tǒng)的重要參與者,也是非特異性免疫和特異性免疫的主要橋梁。TLRs廣泛表達于免疫細胞，TLRs的配體作為佐劑能激活機體的天然免疫和獲得性免疫應答，誘導機體的Th1類反應，從而加速病原體的清除和腫瘤細胞的凋亡。

大量研究顯示LMS具有廣泛的免疫調節(jié)活性,作為佐劑能可使免疫功能低下機體免疫功能恢復正常，增強正常機體細胞免疫和體液免疫功能。其免疫調節(jié)活性作用機理在于：具有擬膽堿能樣活性，且該活性與其分子結構中的咪唑基團有關；誘導機體產(chǎn)生各種淋巴因子，促進T淋巴細胞的成熟；代謝產(chǎn)物具有清除自由基的功能，保護細胞免受氧化自由基的損傷。