[發明專利]一種用于篩選抗骨質疏松藥物的細胞共培養模型及其應用

在審

• 申請號: 201310684073.2
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN104694468A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 肖紅斌;劉艷秋;程孟春
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明屬于細胞體外培養技術領域，具體涉及一種骨髓間充質干細胞/破骨前體細胞/卵泡顆粒細胞共培養模型進行抗骨質疏松藥物篩選的模型及其應用

背景技術

隨著社會老齡化的進程，骨質疏松的發病率呈上升趨勢，目前全球有2億骨質疏松患者，并且女性多于男性。中國老年人居于世界首位，現有骨質疏松患者9000萬，占總人口的7.1%。預計到2050年，全球骨質疏松患者將增加到2.21億，那時全世界一半以上的骨質疏松性骨折將發生在亞洲，絕大部分在中國。日趨嚴峻的骨質疏松發病情況提示，臨床現用的抗骨質疏松藥物效果并不理想，因此開發新的抗骨質疏松藥物的任務迫在眉睫。

近年來研究資料表明，骨重建失衡是骨質疏松的關鍵致病因素。當破骨細胞介導的骨吸收超過成骨細胞介導的骨形成，致使骨量減少、骨多孔、脆性增加，導致骨質疏松。國內外大量研究結果表明成骨細胞和破骨細胞通過相互耦聯促進彼此功能。破骨細胞表面表達RANK，與成骨細胞表達的RANKL結合,促進破骨細胞分化，激活骨吸收功能。除了細胞間受體和配體的直接相互作用外，一些分泌型的調控因子也間接調控彼此活性。如破骨細胞的兩個分泌蛋白BMP6和Wnt10b增加，促進了成骨細胞成熟。在去勢大鼠模型上證明雌激素缺乏，導致成骨和破骨細胞表達的雌激素受體α、β比例發生改變。成骨和破骨細胞的相互作用并非成熟階段開始，對于它們來源的前體骨髓細胞，這種相互調控機理既已發生。破骨細胞自身能夠表達磷酸鞘胺醇(S1P)和BMP6，刺激成骨細胞前體－骨髓間充質干細胞MSC?Wnt/BMP信號途徑，促使MSC募集，定向成骨細胞分化，促進骨形成。考慮到維持骨重建的穩定并非由成骨或破骨細胞各自獨立完成，而是由骨組織調節成骨和破骨細胞功效的前體細胞共同參與，卵巢組織的卵泡顆粒細胞釋放雌激素的間接調控作用亦日益受到人們的關注。

目前，抗骨質疏松藥物主要有骨吸收抑制劑，包括雙磷酸鹽、雌激素、雌激素受體調節劑等，骨形成制劑，包括甲狀腺旁激素。但是，由于成骨和破骨細胞的耦聯作用，單獨抑制骨吸收或骨形成均會引起副作用。長期服用雙磷酸鹽會進一步導致骨喪失。長期服用甲狀腺旁激素會增加骨癌的危險性。因此開發既能抑制骨吸收又能增強骨形成的多靶點藥物備受關注，但是一直沒有取得突破。

已有文獻報道中抗骨質疏松藥物體外評價模型主要以單細胞為主，如鼠成骨細胞增殖分化模型、RANKL誘導的破骨細胞分化模型、骨髓間充質干細胞模型等。以及以酶學研究為基礎的模型，如組織蛋白酶K(cathepsin?K)等。上述體外模型并不能較為全面的模擬體內骨重建耦聯情況，作為藥物篩選的評價手段有所缺陷。而調節骨重建藥物的體內動物模型評價方法主要采用：如灌服糖皮質激素、灌胃維甲酸誘導法或雙側卵巢切除法誘導骨質疏松模型等，動物模型雖然能夠更為貼切的模擬骨重建異常的情況，但是周期長、花費大，不適合藥物的前期發現階段的快速評估研究，本領域急需建立新的篩選方式。

發明內容

發明目的?本發明提供一種能夠快速篩選抗骨質疏松藥物的細胞模型。

技術方案

一種抗骨質疏松藥物篩選的骨髓間充質干細胞/破骨前體細胞/卵泡顆粒細胞共培養模型，其特征在于包括骨髓間充質干細胞和破骨前體細胞直接接觸共培養，卵泡顆粒細胞非接觸式共培養，按如下步驟制得：

A、取骨髓間充質干細胞，在300μL培養容器中，培養容器中部橫向設有直徑為0.4-3微米的帶孔半透膜，分為上下兩層培養室，下室中加入80-120μL的含體積濃度10～20%胎牛血清的α-MEM培養液，細胞密度為0.1～1×10⁵個/ml的骨髓間充質干細胞，待其貼壁后換為含10～1000nM地塞米松、1～10mMβ-甘油磷酸鈉﹑5～50μM磷酸維生素c及含體積濃度20%胎牛血清的α-MEM培養液進行培養；再培養7～8d后，棄上清，加入破骨前體細胞RAW264.7培養液，培養液加入量80-120μL，細胞密度為0.1～1×10⁵個/ml，待其貼壁后換為含10～1000nM地塞米松、1～10mMβ-甘油磷酸鈉﹑5～50μM磷酸維生素c、20～100ng/ml?RANKL及含體積濃度10～20%胎牛血清的α-MEM培養液進行培養；繼續培養2～4d后，再將細胞密度為0.1～1×10⁵個/ml的50-120μL的卵泡顆粒細胞培養液加入上層培養室，將培養容器中所有的培養液換為無血清的α-MEM培養液，置35～37℃，于通入有體積分數為5%的CO₂空氣的培養箱內培養1～2d。