[發明專利]一種用于篩選抗骨質疏松藥物的細胞共培養模型及其應用

在審

• 申請號: 201310684073.2
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN104694468A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 肖紅斌;劉艷秋;程孟春
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種用于篩選抗骨質疏松藥物的細胞共培養模型，其特征在于：其包括骨髓間充質干細胞和破骨前體細胞直接接觸培養，卵泡顆粒細胞非直接接觸培養，按如下步驟制得：

于300μL培養容器中，培養容器中部橫向設有帶孔的半透膜，將培養容器分隔成上下兩層培養室，半透膜上孔的直徑為0.4-3微米；

取骨髓間充質干細胞于容積80-150μL下層培養室培養，于下室中加入80-120μL的含體積濃度10～20%胎牛血清的α-MEM培養液，細胞密度為0.1～1×10⁵個/ml的骨髓間充質干細胞，待其貼壁后換為含10～1000nM地塞米松、1～10mMβ-甘油磷酸鈉﹑5～50μM磷酸維生素c及含體積濃度20%胎牛血清的α-MEM培養液進行培養；再培養7～8d后，棄上清，加入破骨前體細胞RAW264.7培養液，培養液加入量50-120μL，細胞密度為0.1～1×10⁵個/ml，待其貼壁后換為含10～1000nM地塞米松、1～10mMβ-甘油磷酸鈉﹑5～50μM磷酸維生素c、20～100ng/ml?RANKL及含體積濃度10～20%胎牛血清的α-MEM培養液進行培養；繼續培養2～4d后，再將細胞密度為0.1～1×10⁵個/ml的100-120μL的卵泡顆粒細胞培養液加入上層培養室，將培養容器中所有的培養液換為無血清的α-MEM培養液，置35～37℃，于通入有體積分數為5%的CO₂空氣的培養箱內培養1～2d。

2.一種權利要求1所述的細胞共培養模型在進行抗骨質疏松藥物篩選中的應用，其特征在于：

在骨髓間充質干細胞/破骨前體細胞/卵泡顆粒細胞共培養模型的共培養細胞的培養液內，在骨髓間充質干細胞貼壁后給予0.001～200μg/ml的待篩選藥物，以未加藥組作為空白對照組；

在培養箱中35～37℃，通入有體積分數為5%的CO₂空氣進行靜置培養12～14d后，收集40～100μL上清液和上層培養室的卵泡顆粒細胞裂解液10～20μL，檢測50～120μL溶液的雌二醇的含量；

下層培養室的骨髓間充質干細胞和破骨細胞前體用檸檬酸-丙酮溶液固定，染色法檢測堿性磷酸酶ALP表達陽性細胞數；細胞再次洗滌后，以pNPP作為底物檢測抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP活力；

與未加藥組相比，第一種情況：增加ALP值、同時減少或不影響TRAP值、升高或不影響雌二醇值；第二種情況：減少TRAP值，同時增加或不影響ALP值、升高或不影響雌二醇值；以上兩種情況可認定具有調節骨重建活性，可作為骨質疏松的候選藥物。否則不能作為骨質疏松的候選藥物；此模型可應用于中藥提取物或任一化合物的篩選。

3.按照權利要求2所述的應用，其特征在于：

待篩選藥物于培養液內中的濃度在0.01～200μg/ml范圍內取4-10個以上的不同劑量值分別進行細胞共培養模型的藥物篩選，且每個劑量值取2個以上的細胞共培養模型做為重復的平行實驗組。

4.按照權利要求2所述的應用，其特征在于：檢測指標的含量范圍為雌二醇50-120pg/ml,下層培養室底面積為0.32cm²的培養容器中ALP陽性細胞數為1-40個/培養容器，培養容器底面積為0.32cm²的培養容器中405nm波長下TRAP吸光度值為0.1-2.0。