[發(fā)明專利]一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲(chóng)安全性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310682486.7
• 申請(qǐng)日: 2013-12-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103695541A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許崇任;王戎疆;李家練;李茹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲(chóng)安全性的方法，其特征在于，通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得轉(zhuǎn)基因植物中外源基因與秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組中相同短片段，通過(guò)將短片段克隆和轉(zhuǎn)化來(lái)飼喂秀麗隱桿線蟲(chóng)，根據(jù)秀麗隱桿線蟲(chóng)的表型差異來(lái)檢測(cè)外源基因?qū)€蟲(chóng)的安全性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）序列的生物信息學(xué)分析

將轉(zhuǎn)基因作物外源基因的核苷酸序列與秀麗隱桿線蟲(chóng)的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出完全匹配且長(zhǎng)度≥17bp的目的基因片段，再將這些目的片段在Wormbase數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，找出與秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組中外顯子反相互補(bǔ)的目的基因片段；

2）重復(fù)片段表達(dá)載體的構(gòu)建及宿主菌的轉(zhuǎn)化

i.將找到的與秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組中外顯子反相互補(bǔ)的目的基因片段分別以5和10的倍數(shù)進(jìn)行拷貝，兩端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)堿基，合成5個(gè)和10個(gè)拷貝的重復(fù)目的基因片段；

ii.將目的基因片段與含有兩個(gè)相反方向的T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體L4440分別用相同的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，切割后的目的片段和表達(dá)載體以3:1的比例進(jìn)行連接，使目的片段連入表達(dá)載體的兩個(gè)T7啟動(dòng)子之間；

iii.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans109的感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于LB培養(yǎng)基上，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115的感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；

3）對(duì)照組的選擇和表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)Wormbase數(shù)據(jù)庫(kù)中秀麗隱桿線蟲(chóng)的基因信息，選擇3個(gè)基因rpl-2,fem-1和hrp-1作為陽(yáng)性對(duì)照；分別在這3個(gè)基因上選擇長(zhǎng)度為700bp、200bp和100bp的片段，設(shè)計(jì)引物，兩端加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，按步驟2）中目的基因片段的克隆方法，連接到表達(dá)載體L4440中；

4）飼喂秀麗隱桿線蟲(chóng)

iv.將E.coli?OP50涂布于NGM培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)過(guò)夜；挑取秀麗隱桿線蟲(chóng)于含有E.coli?OP50的NGM培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)；

v.將步驟2）中含有目的基因片段克隆表達(dá)載體的大腸桿菌HT115接種于含1mmol/L?IPTG的NGM培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)過(guò)夜以誘導(dǎo)dsRNA的產(chǎn)生；將處于L3生長(zhǎng)期的線蟲(chóng)放到該培養(yǎng)基上飼養(yǎng)至產(chǎn)卵，待線蟲(chóng)大量產(chǎn)卵后，移除成蟲(chóng)；

vi.每個(gè)處理組及對(duì)照組設(shè)置5個(gè)平板，每個(gè)平板中接入20條F1代線蟲(chóng)；在F1代線蟲(chóng)產(chǎn)卵期間，每天更換一次平板；待產(chǎn)卵期結(jié)束后，每?jī)商旄鼡Q一次平板；統(tǒng)計(jì)F1代線蟲(chóng)的產(chǎn)卵數(shù)量及存活時(shí)間，進(jìn)而檢測(cè)外源基因?qū)ν寥谰€蟲(chóng)的安全性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3）中分別針對(duì)3個(gè)基因rpl-2,fem-1和hrp-1的長(zhǎng)度為700bp、200bp和100bp的片段，設(shè)計(jì)的引物如下：