[發明專利]一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法

有效

• 申請號: 201310682486.7
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103695541A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 許崇任;王戎疆;李家練;李茹
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法。

背景技術

從1996年轉基因作物開始大規模的種植到現在，已經有16年的歷史，轉基因作物在環境中的大規模釋放，使得轉基因作物的安全性越來越成為人們關注的焦點，并引發了不少的爭論。轉基因作物的風險評估一直是伴隨著轉基因作物的研究而開展的，并且也一直是轉基因作物獲得許可的一個重要環節。根據2001年歐洲議會發布的2001/18/EC指令，轉基因作物風險評估的目的是在個案分析的原則上確定和評估轉基因作物可能對人類健康和環境造成的直接或間接、短期或長期的負面影響（Craig?et?al.2008）。轉基因作物的風險評估的一項重要內容就是轉基因作物的環境安全，包括對非靶標生物以及生物多樣性的影響、基因漂移以及重組的風險和靶標生物的抗性演化風險等。轉基因作物中轉入的外源蛋白和外源基因可以通過花粉、根際分泌物以及作物殘體等形式在環境中進行擴散，這可能對轉基因的非靶標生物產生影響。

所有的轉基因作物都有一些非靶標的物種存在，這些物種大致可以分為以下幾類：a.農業害蟲的天敵（比如瓢蟲）和傳粉者（比如蜜蜂）；b.非靶標的食草動物；c.土壤生物；d.保護物種（比如黑脈金斑蝶）；e.對地方生物多樣性有貢獻的物種（Snow?et?al.2005；Andow?and?Hilbeck2004）。由于外源蛋白和外源基因可以通過根際分泌物以及作物殘體等形式在土壤中殘留，轉基因作物對土壤生物的非靶標效應也成為研究者關注的一個重點。已經有不少研究者開始研究轉基因作物對彈尾目昆蟲（Folsomia?candida）、螨類（Scheloribates?praeincisus）、蚯蚓（Enchytraeus?albidus）以及甲蟲（Poecilus?chalcites）等土壤生物的影響（袁一楊和戈峰2010）。

土壤中的線蟲無論是在在自然生態系統和農業生態系統中占據著重要位置。土壤中自由生活的線蟲的取食范圍包括細菌、真菌、藻類、原生動物以及腐殖質等，而寄生性線蟲則在動物和植物中均有發現。土壤線蟲作為分解者參與環境中的氮循環和碳循環，是土壤食物鏈的一個關鍵環節。這使得線蟲越來越多的被應用為土壤生態系統的指示生物。土壤線蟲中屬于線蟲動物門胞管腎綱小桿目小桿科隱桿線蟲屬的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis?elegans）作為一種重要的模式生物，不僅在分子生物學以及發育生物學方面取得了很多重要的研究成果，也越來越多的應用于環境毒理學方面的研究，在環境評估中發揮著越來越重要的作用。在早期的研究中，常使用致死率作為評估的標準，而在后來的研究中，有更多反映亞致死情況的指標被應用到對環境的風險評估中來，比如生長和繁殖，取食和用計算機追蹤的方法來反映運動機能等（Sochová?et?al.2006；Leung?et?al.2008；et?al.2009）。

在目前研究轉基因作物對土壤生物的非靶標效應中，一般考察殘留在土壤中的外源蛋白（如Bt蛋白）對土壤生物的毒副作用，而不考慮外源基因的影響。對于一般的生物來說，除了基因漂移和重組以外，外源基因難以對其產生影響。但是，通過對模式生物秀麗隱桿線蟲的研究，發現線蟲是一種可以通過注射、浸泡和取食雙鏈RNA等方式來影響自身基因表達，產生RNAi效應的生物。這種外源基因對土壤線蟲的非靶標效應是之前研究中沒有得到監測的缺失環節。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法，通過生物信息學分析獲得轉基因植物中外源基因與秀麗隱桿線蟲基因組中相同短片段，通過將短片段克隆和轉化來飼喂秀麗隱桿線蟲，根據秀麗隱桿線蟲的表型差異來檢測外源基因對線蟲的安全性。

通過構建含有外源基因與秀麗隱桿線蟲相同短片段的表達雙鏈RNA的載體，轉入大腸桿菌中飼喂秀麗隱桿線蟲，利用RNAi的方法，檢測轉基因作物中的外源基因是否對秀麗隱桿線蟲造成影響。

具體地，所述方法包括以下步驟：

1）序列的生物信息學分析

將轉基因作物外源基因的核苷酸序列與秀麗隱桿線蟲的全基因組序列進行比對分析，找出完全匹配且長度≥17bp的目的基因片段，再將這些目的片段在Wormbase數據庫中進行檢索，找出與秀麗隱桿線蟲基因組中外顯子反相互補的目的基因片段；

2）重復片段表達載體的構建及宿主菌的轉化