[發明專利]一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統及方法

有效

• 申請號: 201310681131.6
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103667350A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 王彥刈
• 申請（專利權）人: 杭州電子科技大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

1.?一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統,其特征在于分為三質粒載體系統、二質粒載體系統兩種類型；其中三質粒載體系統包括逆轉錄病毒表達載體、原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體或沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA、新嗜性病毒包膜蛋白表達載體、原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞；二質粒載體系統包括逆轉錄病毒表達載體、新舊病毒包膜蛋白基因變換載體、原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞。

2.如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統,其特征在于沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA為靶向原嗜性包裝細胞包膜蛋白基因的雙鏈siRNA。

3.如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統,其特征在于原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體為帶有能使原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白表達沉默的表達盒的載體，包含有1個或多個能使原嗜性包膜蛋白表達沉默的表達盒，表達盒包含有啟動沉默包裝細胞病毒原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA轉錄的啟動子核苷酸序列、編碼shRNA或siRNA或miRNA的核苷酸序列、終止轉錄序列，其中驅動轉錄shRNA、miRNA是Pol?II或Pol?III啟動子,驅動轉錄siRNA為Pol?III啟動子；表達siRNA的表達盒包含有轉錄雙鏈siRNA的相對的兩個Pol?III啟動子序列、編碼siRNA的核苷酸序列，該兩個Pol?III啟動子至少在-5到-1位突變為腺嘌呤A的脫氧核糖核苷酸，相互為另一個Pol?III啟動子提供終止信號poly?T。

4.如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統,其特征在于所述的新嗜性病毒包膜蛋白表達載體為不同于包裝細胞原嗜性的其他嗜性包膜蛋白表達質粒，包含有其他嗜性包膜蛋白的表達盒，該表達盒包含Pol?II啟動子核苷酸序列、編碼其他嗜性包膜蛋白的核苷酸序列、終止信號序列。

5.如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統,其特征在于所述的新舊病毒包膜蛋白基因變換載體為載有沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的元件和表達新嗜性病毒包膜蛋白的元件的組合載體質粒，其中沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的元件包含1個或多個沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA表達盒，表達新嗜性病毒包膜蛋白的元件為表達新嗜性病毒包膜蛋白的表達盒；其中表達miRNA的表達盒與表達新嗜性包膜蛋白表達盒共用一個Pol?II啟動子與poly?A終止信號或分別使用不同的啟動子與終止信號。

6.利用如權利要求1所述的一種改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統制備不同嗜性的逆轉錄病毒的方法，其特征在于該方法包括兩種形式，一種是將三質粒載體系統中逆轉錄病毒表達載體質粒、原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體或沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA、新嗜性病毒包膜蛋白表達載體瞬時共轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞內，或者將二質粒載體系統中逆轉錄病毒表達載體質粒、新舊病毒包膜蛋白基因變換載體瞬時共轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞內，各質粒中表達盒在細胞中瞬時表達，得到新嗜性的逆轉錄病毒；

另一種是首先將三質粒載體系統中的原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白沉默載體與新嗜性病毒包膜蛋白表達載體或二質粒載體系統中的新舊病毒包膜蛋白基因變換載體轉染至原嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，然后用藥物篩選出穩定表達細胞株，獲得穩定的新嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，然后把逆轉錄病毒表達載體質粒轉染至此新嗜性逆轉錄病毒包裝細胞，得到新嗜性的逆轉錄病毒。

7.如權利要求6所述的利用改變逆轉錄病毒包裝細胞嗜性的載體系統制備不同嗜性的逆轉錄病毒的方法,其特征在于沉默原嗜性包裝細胞病毒包膜蛋白的雙鏈siRNA為靶向原嗜性包裝細胞包膜蛋白基因的雙鏈siRNA。