[發(fā)明專利]一種改變逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞嗜性的載體系統(tǒng)及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310681131.6
• 申請(qǐng)日: 2013-12-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103667350A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王彥刈
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州電子科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N7/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

技術(shù)領(lǐng)域

發(fā)明涉及一種改變逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞嗜性的載體系統(tǒng)及方法，尤其是能包裝出與包裝細(xì)胞原嗜性不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝載體系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種轉(zhuǎn)移基因很有效的基因轉(zhuǎn)移載體，在基因工程或基因治療領(lǐng)域，野生型的逆轉(zhuǎn)錄病毒由于在宿主細(xì)胞能不斷復(fù)制，具有毒性。為了阻止其病毒在宿主細(xì)胞復(fù)制，gag-pol和env（envelope）基因從病毒基因組中被剔除，使得病毒載體不具有復(fù)制性，在此病毒載體中可以插入我們想要轉(zhuǎn)移的目的基因，因此變?yōu)閹в心康幕虻臒o(wú)毒性的基因轉(zhuǎn)移病毒載體（通稱：逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）。而gag-pol和env基因通過(guò)基因工程的方法被轉(zhuǎn)移到容易培養(yǎng)的細(xì)胞（比如293細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞等）中穩(wěn)定表達(dá)，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入該穩(wěn)定表達(dá)gag-pol和env基因的細(xì)胞中后，產(chǎn)生的病毒RNA就可被包裝成具有感染性的帶有目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子，因此能穩(wěn)定表達(dá)gag-pol和env基因的細(xì)胞我們稱之為包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞中表達(dá)的env蛋白能與要進(jìn)入的宿主細(xì)胞膜表面的受體蛋白結(jié)合，因此該env蛋白決定了包裝出的逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染什么種類的細(xì)胞，即病毒的嗜性（tropism）。根據(jù)env的不同，可以分為單嗜性（ecotropic）、多嗜性（amphotropic）、雙嗜性（dualtropic）和泛嗜性（pantropic）的包裝細(xì)胞，它們分別表達(dá)gap70、4070A、10A1、VSV-G包膜蛋白。單嗜性的包裝細(xì)胞包裝出的逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染小鼠和大鼠細(xì)胞，因?yàn)榘b出的病毒其包膜蛋白只能與小鼠或大鼠細(xì)胞上的受體結(jié)合；相似地，由多嗜性（amphotropic）、雙嗜性（dualtropic）和泛嗜性（pantropic）的包裝細(xì)胞包裝出的病毒能分別感染表達(dá)多嗜性受體Ram-1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、能表達(dá)Ram-1或GALV受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞及非哺乳動(dòng)物細(xì)胞（參考文獻(xiàn)1.Burns,J.C.,Friedmann,T.,Driever,W.,Burrascano,M.&?Yee,J.-K.(1993)Vesicular?stomatitis?virus?G?glycoprotein?pseudotyped?retroviral?vectors:concentration?to?very?high?titer?and?efficient?gene?transfer?into?mammalian?and?nonmammalian?cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA?90:8033–8037.）。泛嗜性的病毒是由水泡性口炎病毒（vesicular?stomatitis?virus，VSV）包膜蛋白(VSV-G)包裝成的病毒，它進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式不同于其他嗜性的病毒，不經(jīng)過(guò)與受體結(jié)合，而是通過(guò)脂質(zhì)結(jié)合通過(guò)細(xì)胞膜融合而進(jìn)入宿主細(xì)胞（參考文獻(xiàn)2?Emi,N.,Friedmann,T.&?Yee,J.-K.(1991)Pseudotyped?formation?of?murine?leukemia?virus?with?G?protein?of?vesicular?stomatitis?virus.J.Virol.65:1202–1207.），因此它能進(jìn)入幾乎所有的哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

目前已經(jīng)建立了多種包裝細(xì)胞并可通過(guò)商業(yè)途徑獲得，比如基于NIH-3T3細(xì)胞的PT67、PA317等，基于HEK293細(xì)胞的BOSC23、Phoenix-E、Plat-E、GP2-293等，這些包裝細(xì)胞在建立時(shí)都已穩(wěn)定轉(zhuǎn)入了特定的包膜蛋白，因此它們的嗜性都已經(jīng)決定了。當(dāng)我們想用這些嗜性決定了的包裝細(xì)胞包裝出其他嗜性的病毒時(shí)，往往沒(méi)有辦法做到。到目前為止，直接用現(xiàn)有已確定了嗜性的包裝細(xì)胞來(lái)包裝不同嗜性的逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法還未見(jiàn)到。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改變逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞嗜性的載體系統(tǒng)，可以簡(jiǎn)單地拓展或改變現(xiàn)有包裝細(xì)胞的嗜性范圍，使包裝出的逆轉(zhuǎn)錄病毒從原本只能感染某些種類細(xì)胞改變?yōu)槟軌蚋腥酒渌N類細(xì)胞或能夠感染更大范圍種類的細(xì)胞，比如使原本只能包裝出感染鼠源細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒變?yōu)槟軌虬b出感染包括人源細(xì)胞在內(nèi)的多種種類的細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒，為以逆轉(zhuǎn)錄病毒為基因載體的基因工程或基因治療提供新的方法。

本發(fā)明載體系統(tǒng)分為三質(zhì)粒載體系統(tǒng)、二質(zhì)粒載體系統(tǒng)兩種類型。