[發明專利]甘蔗梢腐病病原菌小種gx1的分子檢測方法

有效

• 申請號: 201310680156.4
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103882109A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 張木清;林鎮越
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州市眾韜專利代理事務所(普通合伙) 35220
• 代理人: 林友明

技術領域

本發明涉及一種植物病害的檢測方法，具體涉及一種甘蔗梢腐病病原菌（Fusarium?moniliforme）小種gx1的分子檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

鐮刀菌屬(Fusarium)最早由Link(1809)發現的粉紅鐮刀菌(F.roseum)，并以此為基礎而建立的屬內分類。鐮刀菌屬的種類繁多，據Dictionary?of?Fungi記載，至今已報道的鐮刀菌超過500種。鐮刀菌屬是農作物及經濟作物的最重要病原真菌之一，是一種最為常見的寄生病原菌，嚴重影響谷類植物的生長及糧食生產。而且鐮刀菌在植物的寄主范圍很廣，可侵染大多數植物并造成毀滅性的病害，如引起香蕉萎蔫病的尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、水稻惡苗病和甘蔗梢腐病的串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、小麥赤腐病的禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、玉米根腐病的梨孢鐮刀菌（F.poae）、豆科和瓜類植物根莖腐爛的茄類鐮刀菌(F.solani)等。鐮刀菌不但會造成作物嚴重的減產和損失，而且可產生多種次生代謝產物的真菌毒素，如伏馬菌素與AAL毒素等具有很強的毒性，能殺死植物細胞核；或富集于糧食的谷粒或種子內，食用后能引發人及家畜肝臟、腎臟的衰竭和癌變(Roche，2010)。

甘蔗是重要的糖料作物和理想的能源作物，在甘蔗種植中長期受到真菌性病害的影響，其中鐮刀菌是甘蔗真菌性病害中最為嚴重的病原之一，鐮刀菌屬所引起的甘蔗梢腐病，主要流行于亞熱帶和東南亞沿海甘蔗種植區，爆發于高溫雨季時期(Viswanathan等，2006)。近年來，該病呈逐漸加重趨勢。Hsuan基于形態學和DNA的翻譯延伸因子1-α（TEF-1α）基因對甘蔗、玉米和水稻上寄生鐮刀菌菌株進行初步鑒別和分類，得到包括F.sacchari,F.moniliforme,F.proliferatum,F.andiyazi，F.verticillioides，G.moniliforme等多個種類的鐮刀菌，提出由于寄主的差異，可能對鐮刀菌種類要進行新的分類，而不能僅依據形態學鑒定的假說（Shuan等，2010）。

目前通過對中國大陸甘蔗各產區的梢腐病調查采樣及病原菌的生物地理學研究，對所有采集樣品的病原菌分離培養，經形態學鑒定和分子生物學鑒定，以ITS序列聚類分析，初步鑒定中國大陸甘蔗梢腐病病原主要是單一種類鐮刀菌F.moniliforme，但有兩個小種（gx1和gx2），其中gx1為優勢小種。如何對中國甘蔗梢腐病原優勢小種gx1進行快速的分類鑒定，不論對植物病理的基礎研究還是甘蔗病害防治的應用研究都具有十分重要的現實意義。

發明內容

本發明目的是提供一種甘蔗梢腐病病原菌（Fusarium?moniliforme）小種gx1的分子檢測方法。所述甘蔗梢腐病病原菌小種gx1，指引起我國甘蔗梢腐病的優勢小種，并具有以下特定的核苷酸序列：

GACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGGGGAACGCGATTTGACTCGCGAGTCCCAACACCAAGCTGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACA。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

本發明的甘蔗梢腐病病原菌小種gx1的分子檢測方法，首先是依據gx1小種的測序ITS序列，設計用于實時定量PCR的若干引物和Taqman探針組合FAM-gx1以及用于常規半定量PCR的若干引物對Pgx1。

一種利用分子檢測方法檢測甘蔗梢腐病病原菌小種gx1的引物和探針組合FAM-gx1，其特征在于所述引物和探針組合為下列6個組合中的1個組合；6個引物探針組合如下：

FAM-gx1第1組：

引物：FAM-gx1-F1：5’-CCTGATCCGAGGTCAACATTC-3’

FAM-gx1-R1：5’-TCGAGCTTCCATAGCGTAGTA-3’

探針：FAM-gx1-P1：5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’；

FAM-gx1第2組：

引物：FAM-gx1-F2：5’-TGCTTAAGTTCAGCGGGTATT-3’

FAM-gx1-R2：5’-GTCACGTCGAGCTTCCATAG-3’

探針：FAM-gx1-P2：5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’；

FAM-gx1第3組：