[發(fā)明專利]甘蔗梢腐病病原菌小種gx1的分子檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310680156.4
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103882109A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張木清;林鎮(zhèn)越
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州市眾韜專利代理事務(wù)所(普通合伙) 35220
• 代理人: 林友明

1.一種利用分子檢測方法檢測甘蔗梢腐病病原菌小種gx1的引物和探針組合FAM-gx1，其特征在于所述引物和探針組合為下列6個組合中的1個組合：

FAM-gx1第1組：

引物：FAM-gx1-F1：5’-CCTGATCCGAGGTCAACATTC-3’

FAM-gx1-R1：5’-TCGAGCTTCCATAGCGTAGTA-3’

探針：FAM-gx1-P1：5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’；

FAM-gx1第二組：

引物：FAM-gx1-F2：5’-TGCTTAAGTTCAGCGGGTATT-3’

FAM-gx1-R2：5’-GTCACGTCGAGCTTCCATAG-3’

探針：FAM-gx1-P2：5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’；

FAM-gx1第三組：

引物：FAM-gx1-F3：5’-CGATTACCAGTAACGAGGGTTT-3’

FAM-gx1-R3：5’-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’

探針：FAM-gx1-P3：5’-TACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGA-3’；

FAM-gx1第四組：

引物：FAM-gx1-F4：5’-CTGTTCGAGCGTCATTTCAAC-3’

FAM-gx1-R4：5’-GACGATTACCAGTAACGAGGG-3’

探針：FAM-gx1-P4：5’-CGCGAGTCCCAACACCAAGC-3’；

FAM-gx1第五組：

引物：FAM-gx1-F5：5’-CGCAATGTGCGTTCAAAGAT-3’

FAM-gx1-R5：5’-ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’

探針：FAM-gx1-P5：5’-TTTGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’；

FAM-gx1第六組：

引物：FAM-gx1-F6：5’-TGGGCTTGAGGGTTGAAATG-3’

FAM-gx1-R6：5’-TCGATGAAGAACGCAGCAAA-3’

探針：FAM-gx1-P6：5’-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCC-3’；

所述Taqman探針的5’端、3’端分別用FAM報(bào)導(dǎo)熒光染料和BHQ-1淬滅基團(tuán)標(biāo)記。

2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組檢測甘蔗梢腐病病原菌小種gx1的方法，包括提取甘蔗梢腐病病原菌小種gx1的DNA、建立qPCR檢測的反應(yīng)體系、qPCR檢測的反應(yīng)程序、定量qPCR檢測，其特征在于步驟如下：

（1）提取甘蔗梢腐病病原菌小種gx1的DNA：采集甘蔗梢腐病樣品，經(jīng)分離純化培養(yǎng)病原菌的樣品提取病原菌DNA；或直接提取病建交界處的葉片DNA；

（2）建立qPCR檢測的反應(yīng)體系：qPCR檢測的反應(yīng)體系為1/10體積的10倍PCR反應(yīng)緩沖液；dNTP各0.1～0.5mmol/L；Taq?DNA聚合酶0.1～5國際單位;Taqman探針0.1～0.5mmol/L；分離純化的DNA模板液0.1～5μl,；一個組合的引物和探針，各0.1～2nmol/L；加無菌去離子水使總體積達(dá)到10～100μl；

（3）qPCR檢測的反應(yīng)程序：qPCR檢測的反應(yīng)程序?yàn)椋?0-100℃30-60s；90-100℃5-30s，50-70℃20-90s，20～50個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號檢測，熒光模式設(shè)為FAM；

（4）qPCR檢測結(jié)果：qPCR檢測結(jié)果Ct值為0，表示樣品未檢出甘蔗梢腐病病原菌小種gx1。