[發(fā)明專利]一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體、制備方法及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310676481.3
• 申請(qǐng)日: 2013-12-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103710383A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙曉麗;呂維加
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/87;C08B37/08;A61K48/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

基因治療通過(guò)將目的基因?qū)氲桨屑?xì)胞核內(nèi)以修復(fù)或置換導(dǎo)致疾病的缺陷基因，為先天和后天的基因缺陷疾病提供了新的治療方法，尋求合適的轉(zhuǎn)基因載體將目的基因?qū)氲桨屑?xì)胞內(nèi)無(wú)疑成為基因治療成功與否的關(guān)鍵所在。

目前，轉(zhuǎn)基因載體主要有非病毒載體，非病毒載體主要包括殼聚糖、脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺(PEI)和樹(shù)枝狀高聚物(Dendrimer)等，這些非病毒載體通過(guò)靜電作用與DNA復(fù)合形成納米微球進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。其中，殼聚糖(Chitosan)作為唯一的天然陽(yáng)離子多糖，具有良好的生物相容性、低細(xì)胞毒性和可降解性等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛地應(yīng)用于非病毒轉(zhuǎn)基因載體。但殼聚糖作為非病毒轉(zhuǎn)基因載體時(shí)轉(zhuǎn)染效率較低，成為制約其在實(shí)際臨床應(yīng)用中的瓶頸，因此，如何提高非病毒轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)染效率成為研究重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明第一方面旨在提供一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，該非病毒轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染效率良好；本發(fā)明第二方面旨在提供一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，該制備方法簡(jiǎn)單，制備的非病毒轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染效率良好；本發(fā)明第三方面旨在提供一種用于基因治療的納米復(fù)合物，該納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率良好；本發(fā)明第四方面旨在提供一種用于基因治療的納米復(fù)合物的制備方法，該納米復(fù)合物的制備方法簡(jiǎn)單，制備得到的用于基因治療的納米復(fù)合物細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率良好。

第一方面本發(fā)明提供了一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述精氨酸短肽的一端通過(guò)酰胺鍵與所述殼聚糖相連。

優(yōu)選地，所述精氨酸短肽為2～19個(gè)精氨酸脫水縮合得到。

優(yōu)選地，所述殼聚糖的分子量為5kDa～100kDa。

現(xiàn)有技術(shù)中，精氨酸短肽是一種穿膜肽，在生理?xiàng)l件下精氨酸短肽帶有大量的正電荷，能夠快速與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜上的磷脂分子作用，啟動(dòng)細(xì)胞膜外物質(zhì)的跨膜傳輸，從而將細(xì)胞膜外物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，且不損傷細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力，轉(zhuǎn)運(yùn)效率高。因此被廣泛用于傳遞各種蛋白、大分子和納米粒子進(jìn)入細(xì)胞。

本發(fā)明提供了一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體上的精氨酸短肽單元可以與細(xì)胞膜上的磷脂分子相互作用，而促進(jìn)所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)染效率高。

第二方面本發(fā)明提供了一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，包括以下步驟：

（1）提供精氨酸短肽；將所述精氨酸短肽和活化劑溶解于緩沖液中得到精氨酸短肽溶液；

（2）將殼聚糖溶解后得到殼聚糖溶液，將所述殼聚糖溶液滴加到所述精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，攪拌反應(yīng)1～6天，所述混合溶液中的氨酸短肽和殼聚糖發(fā)生酰胺化反應(yīng)，得到產(chǎn)物，將所述產(chǎn)物分離純化后進(jìn)行冷凍干燥，得到所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體；所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體為精氨酸短肽改性的殼聚糖，所述精氨酸短肽的一端通過(guò)酰胺鍵與所述殼聚糖相連。

優(yōu)選地，步驟（1）中所述精氨酸短肽為2～19個(gè)精氨酸脫水縮合得到。

優(yōu)選地，步驟（1）中所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽中的至少一種。

優(yōu)選地，步驟（2）中所述殼聚糖的分子量為5kDa～100kDa。

優(yōu)選地，所述精氨酸短肽和所述殼聚糖的摩爾比為1:1～1:20。

所述殼聚糖和精氨酸短肽通過(guò)酰胺化反應(yīng)一步合成所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體，制備方法簡(jiǎn)單，原料廉價(jià)易得，制得的非病毒轉(zhuǎn)基因載體中的精氨酸短肽單元能與細(xì)胞膜上的磷脂分子相互作用，而促進(jìn)所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高。

第三方面，本發(fā)明提供了一種用于基因治療的納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物為質(zhì)粒DNA和上述所述的非病毒轉(zhuǎn)基因載體通過(guò)靜電作用形成的納米微球。

所述精氨酸短肽和殼聚糖發(fā)生酰胺化反應(yīng)，將具有穿膜作用的精氨酸短肽連接到殼聚糖上，得到具有穿膜效果的非病毒轉(zhuǎn)基因載體，所述非病毒轉(zhuǎn)基因載體能夠有效復(fù)合DNA形成納米復(fù)合物，所述納米復(fù)合物上的精氨酸短肽單元能與細(xì)胞膜上的磷脂分子相互作用，促進(jìn)納米復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了目的基因的投遞，有利于目的基因后續(xù)的表達(dá)。

第四方面，本發(fā)明提供了一種用于基因治療的納米復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：