[發(fā)明專利]一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310676168.X
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103667489A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 鄭嫩珠;辛清武;繆中緯;朱志明
• 申請（專利權）人: 福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發(fā)明涉及一種有效鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，屬于分析生物化學技術領域。

背景技術

DNA分子標記是以個體間核苷酸變異為基礎的遺傳標記，直接在DNA水平上檢測生物個體間的差異，是生物個體在DNA水平上遺傳變異的直接反映，與應用表型性狀、生產性能、生化標記等方法相比，更能真實的反映禽種的遺傳背景和親緣關系。利用家禽品種DNA遺傳標記技術，其結果可作為鑒定家禽品種真?zhèn)蔚目茖W依據。

DNA溯源技術使用的分子標記有AFLP（擴增片段長度多態(tài)性）標記、SSR（微衛(wèi)星）標記和SNP（單核苷酸多態(tài)性）標記。SNP標記是1996年美國學者提出的第三代DNA分子標記。SNP是指基因組同一位點上單個核苷酸的變異，包括轉換、顛換、缺失和插入。SNP是可遺傳的變異中最常見的一種，具有分布廣密度高的特點，平均每1000個堿基便有1個SNP存在。SNP標記因分布廣泛，遺傳穩(wěn)定，并且適宜高通量自動化分析，所以日益成為動物身份識別最受關注的分子標記，并逐步取代AFLP標記和SSR標記。

SNP標記是基因序列單個核苷酸發(fā)生變異而產生多態(tài)性的DNA分子標記，其是二等位基因多態(tài)，因此一個SNP理論上可以區(qū)分三個動物個體，包括兩個純合子和一個雜合子。本發(fā)明即利用SNP標記中的PCR-RFLP技術來區(qū)分家鴨、番鴨、半番鴨三類動物群體。該方法簡便快捷、安全可靠、費用低廉，從本質上有效鑒定和區(qū)分家鴨、番鴨和半番鴨三類鴨群體。

目前，在雛苗市場上，品種來源不純、以次充好的現象時有發(fā)生，該方法的發(fā)明，對于有效解決市場上家鴨、番鴨和半番鴨品種混亂，有效保護家鴨、番鴨和半番鴨品種純正性和優(yōu)良基因的流失均具有重要意義；同時，在一定程度上可以取代番鴨活體保種，為番鴨品種資源保存提供一種最安全、最可靠、維持費用最低的保存方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種有效鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，本發(fā)明主要利用SNP標記中的PCR-RFLP技術來有效區(qū)分家鴨、番鴨、半番鴨三類動物群體。

為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

在含SNP酶切位點的鴨MC1R基因編碼區(qū)設計一對P1引物，引物序列為：

上游引物F：5'—CGTGCCCAACGA?ACTCTT—3'?；

下游引物R：5'—CAGGGCGAACATGTGGA—3'?。

一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，其具體步驟包括：

（1）靜脈采血，EDTA抗凝，-20℃保存；基因組DNA試劑盒提取總DNA，端粒酶（TE）溶解，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）已設計好的引物上游引物：5'—GCCAGTGAGGGCAACCAGAG—3'?

下游引物：5'—CTACCAGGAGCACAGCACCA—3'分別對家鴨、番鴨和半番鴨的DNA進行擴增；產物回收、克隆并正反向測序；應用DNAStar中的SeqMan軟件對測序結果進行比對，搜索SNP；

（3）引物的設計

利用軟件Oligo?6.0和Primer?Primer5.0，在含SNP酶切位點的鴨MC1R基因編碼區(qū)設計一對引物P1，上游引物F與下游引物R；預期擴增出約523bp的PCR條帶；

（4）PCR擴增

利用引物P1對番鴨、半番鴨和家鴨基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為:?2?×?Taq?MasterMix?12.5μL，上游引物F?1μL，下游引物R?1μL，模板?DNA?2μL?，補充ddH2O?至終體積25μL；PCR?反應條件：94?℃?5?min，94?℃?50?s，55.5℃?35?s，72℃?40?s，共?35?個循環(huán)；72?℃?10?min，4?℃保存；PCR?產物經質量分數為?2%?的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果；

（5）PCR-RFLP檢測

取擴增產物5-6μL，加入限制性內切酶Hin6Ⅰ?1μL，10×Buffer?1μL，加ddH₂O至終體積10μL，37℃酶切反應過夜，酶切產物用質量分數為3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DL1000?DNA?Marker作為分子量的標準對照，觀察酶切結果，Bio-Rad凝膠成像系統觀察拍照保存，由帶型判斷基因型；

（6）結果