[發明專利]LAMP1綠色熒光表達載體、其制備方法及應用

在審

• 申請號: 201310675953.3
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號: CN104711281A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 張磊;李紅昌;楊詩涵
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66;C12Q1/02
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 沈祖鋒;郝明琴

【技術領域】

本發明屬于生物技術領域，涉及重組表達載體的構建，具體涉及一種LAMP1綠色熒光表達載體、其制備方法及應用。

【背景技術】

溶酶體（lysosome）是真核細胞中由單層脂蛋白膜包繞的含一系列酸性水解酶的小體，是細胞內吞、細胞自噬兩條代謝途徑的共同終點。溶酶體既能通過與吞噬體融合，酸化水解通過細胞內吞途徑進入細胞的生物大分子物質，調節細胞水平的信號傳遞；又能通過與自噬體融合，降解通過自噬途徑包裹到自噬體中的細胞器和內源性生物大分子，為細胞提供生物合成的新原料。通過熒光顯微技術觀察溶酶體的亞細胞定位對于研究細胞內吞、細胞自噬兩條代謝途徑意義重大。傳統的應用于觀察溶酶體的方法主要是免疫熒光染色和電鏡觀測兩種方法，其中，免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體），在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量，使用抗體將溶酶體體特異性表達的蛋白質LAMP1上標記上熒光信號，可以用熒光顯微鏡下或激光共聚焦顯微鏡觀察溶酶體的亞細胞定位；而電鏡是利用電子與物質作用所產生之訊號來監定微區域晶體結構，微細組織，化學成份，化學鍵結和電子分布情況的檢測手段。使用電鏡技術通過觀測細胞切片或組織切片中細胞微細結構，依據形態可鑒別溶酶體。

以上兩種方法中，使用免疫熒光鑒定溶酶體依賴于高效價的LAMP1抗體，這樣不僅步驟繁瑣，而且實驗成本高；而用電鏡法鑒定溶酶體體，依賴于研究人員豐富的形態學分析經驗，難度比較大，不易于普及；而且上述兩種方法都需要先將細胞固定滅活后，再檢測，無法進行活細胞觀察。

【發明內容】

本發明的目的在于克服上述不足之處，提供一種LAMP1綠色熒光表達載體，解決現有技術中溶酶體靶細胞定位檢測中步驟繁瑣、實驗成本高以及無法進行活細胞檢測的技術問題。

本發明為解決上述技術問題所采用的方案如下：

一種一種LAMP1綠色熒光表達載體，表達LAMP1和綠色熒光蛋白的融合蛋白，所述表達載體以pEGFP-c1載體為骨架載體，在pEGFP-c1載體多克隆位點融合了LAMP1編碼基因。

優選地，所述LAMP1編碼基因位于pEGFP-c1載體的EcoR?I/BamH?I之間。

優選地，所述表達載體的核苷酸序列為序列表中的SEQ?ID?No：5。

本發明還提供了一種制備LAMP1綠色熒光表達載體的方法，包括如下步驟：

步驟1：用人類子宮頸癌細胞Hela細胞的cDNA作為模板進行PCR擴增，獲得含有EcoR?I和BamH?I酶切位點的LAMP1?DNA片段，其中，所述PCR擴增引物為序列表中的SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2；

步驟2：將所得LAMP1DNA片段和pEGFP-c1載體分別用EcoR?I和BamH?I進行雙酶切，得到LAMP1基因和酶切后的pEGFP-c1載體；

步驟3：將所得LAMP1基因和酶切后的pEGFP-c1載體用DNA連接酶進行連接，得到pEGFP-c1-LAMP1載體。

優選地，所述步驟1中PCR擴增的反應條件為：起始98℃5min；然后98℃10s，58℃30s，70℃2min，進行35個循環；最后72℃10min。

優選地，所述步驟2中LAMP1基因和酶切后的pEGFP-c1載體的質量比為2.5:1-5:1；所述步驟2中所用的DNA連接酶為T4DNA連接酶。

優選地，所述步驟2和所述步驟3之間還包括如下步驟：

將所得LAMP1基因和酶切后的pEGFP-c1載體進行純化。

本發明還提供了用上述的表達載體轉染的細胞，其中，所述細胞為真核細胞。

本發明還提供了一種細胞檢測試劑，包括上述的表達載體。

本發明另外還提供了上述的表達載體或上述的細胞檢測試劑在檢測溶酶體在靶細胞中定位的用途。