[發(fā)明專利]LAMP1綠色熒光表達載體、其制備方法及應用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310675953.3 | 申請日： | 2013-12-11 |
| 公開（公告）號： | CN104711281A | 公開（公告）日： | 2015-06-17 |
| 發(fā)明（設計）人： | 張磊;李紅昌;楊詩涵 | 申請（專利權）人： | 中國科學院深圳先進技術研究院 |
| 主分類號： | C12N15/79 | 分類號： | C12N15/79;C12N15/66;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316 | 代理人： | 沈祖鋒;郝明琴 |
| 地址： | 518055 廣東省深圳*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | lamp1 綠色 熒光 表達 載體 制備 方法 應用 | ||
1.一種LAMP1綠色熒光表達載體，其特征在于，表達LAMP1和綠色熒光蛋白的融合蛋白，所述表達載體以pEGFP-c1載體為骨架載體，在pEGFP-c1載體多克隆位點融合了LAMP1編碼基因。
2.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述LAMP1編碼基因位于pEGFP-c1載體的EcoR?I/BamH?I之間。
3.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體的核苷酸序列為序列表中的SEQ?ID?No：5。
4.一種制備LAMP1綠色熒光表達載體的方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟1：用人類子宮頸癌細胞Hela細胞的cDNA作為模板進行PCR擴增，獲得含有EcoR?I和BamH?I酶切位點的LAMP1?DNA片段，其中，所述PCR擴增引物為序列表中的SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2；
步驟2：將所得LAMP1?DNA片段和pEGFP-c1載體分別用EcoR?I和BamH?I進行雙酶切，得到LAMP1基因和酶切后的pEGFP-c1載體；
步驟3：將所得LAMP1基因和酶切后的pEGFP-c1載體用DNA連接酶進行連接，得到pEGFP-c1-LAMP1載體。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1中PCR擴增的反應條件為：起始98℃5min；然后98℃10s，58℃30s，70℃2min，進行35個循環(huán)；最后72℃10min。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2中LAMP1基因和酶切后的pEGFP-c1載體的質量比為2.5:1-5:1；所述步驟2中所用的DNA連接酶為T4DNA連接酶。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2和所述步驟3之間還包括如下步驟：
將所得LAMP1基因和酶切后的pEGFP-c1載體進行純化。
8.用權利要求1至3任一項所述的表達載體轉染的細胞，其特征在于，所述細胞為真核細胞。
9.一種細胞檢測試劑，其特征在于，包括權利要求1至3任一項所述的表達載體。
10.權利要求1至3任一項所述的表達載體或權利要求9所述的細胞檢測試劑在檢測溶酶體在靶細胞中定位的用途。
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