[發明專利]脂肪干細胞庫構建方法

有效

• 申請號: 201310675417.3
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103651331A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 張炳強;于麗;張福琴;孫月光;孫弘
• 申請（專利權）人: 青島中天干細胞工程有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種脂肪干細胞庫的構建方法。

背景技術

脂肪組織中含有一類具有多向分化潛力的細胞，即脂肪間充質干細胞，簡稱脂肪干細胞。其生物學性質與骨髓間充質干細胞相類似，并可向脂肪、骨、軟骨、肌肉、內皮、造血、肝、胰島和神經等多種細胞方向分化。

目前所報道的間充質干細胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法分離獲得。相對于骨髓間充質干細胞，脂肪間充質干細胞有一下優勢：1、脂肪組織在體內分布廣泛，儲量豐富。且脂肪組織取材容易，吸脂手術屬于技術成熟的常規手術，手術風險小，患者痛苦少，這一點尤其利于臨床應用；2、脂肪干細胞的獲取效率要優于骨髓間充質干細胞。?細胞克隆形成實驗表明，間充質干細胞只占到成人骨髓的（0.2～1）×10^-5。而脂肪組織經膠原酶消化后，其中主要的細胞?類型脂肪細胞，很容易通過浮力而去掉，所獲得的間充質干細胞克隆形成率是骨髓間充質干細胞的100～500倍；3，從臨床角度出發，在短時間內更容易獲得大量的脂肪干細胞，對于急性心肌梗塞等疾病的快速治療具有重要意義。在局部麻醉的情況下，成人骨髓的獲取量通常不超過40ml，能獲得大約1.2×10⁹個有核細胞,其中包含大約2.4×10⁴個MSCs。如果想獲得更多的骨髓，則需要全身麻醉，則增加了病人痛苦和發生并發癥的風險；而一次吸脂手術可獲得超過200ml的脂肪組織，且每100ml都能獲得大約2×10⁸個有核細胞，其中含有大約1.2×10⁸的干細胞，相當于相同體積骨髓的2000倍。由此可見，在相同條件下，脂肪組織更具臨床應用潛力。

由于脂肪組織在人體內儲量豐富，獲取簡便創傷小，在組織工程、器官修復、基因治療等方面都有著廣闊的應用前景，因此脂肪間充質干細胞已成為繼骨髓間充質干細胞后干細胞領域另一個備受關注的熱點。

2012年1月，韓國FDA批準的自體脂肪干細胞藥物Cuepistem成功上市，用于治療復雜性克隆氏病并發肛瘺。同年10月，美國FDA批準了Cytori?Therapeutics公司脂肪干細胞對心臟衰竭患者有效性的臨床試驗。而在中國，大部分吸脂手術中得到的脂肪干細胞均被廢棄，得不到有效利用。

為了便于人們有效存儲和使用干細胞資源，目前，在世界范圍內，已經建立了多個干細胞庫。所謂干細胞庫是在約-196℃液氮中（深低溫）存儲干細胞及搜集存儲干細胞資源相關資料的場所。目前，國內干細胞庫按來源分為臍帶血干細胞庫、臍帶間充質干細胞庫、胎盤干細胞庫、牙髓干細胞庫等；按提供方法又分為自體庫和公共庫，公共庫所存儲的干細胞都是他人的干細胞，以滿足需要移植但自體干細胞沒有保存的病人需求。

中國專利授權公告號CN103074298A的專利公布了一種人脂肪間充質干細胞庫及其構建方法，其構建方法由以下步驟組成：1、采集脂肪；2、獲取和分離人脂肪成體干細胞；3，培養人脂肪干細胞；4、檢測和凍存人脂肪成體干細胞；5、建庫。以上構建方法有以下不足：一是耗時長：均是將干細胞制備出后凍存，每份干細胞入庫周期長，步驟繁瑣。二是成本高：供者將脂肪干細胞捐出后，存在公共庫，等待需要的受者使用，在使用前，每份脂肪都制備成干細胞再凍存，所耗用試劑、材料、人工較多，不是每一份干細胞都會用上，這就使得公共庫成本增高。

發明內容

????本發明的目的是為了克服現有技術中存在的問題，提供一種脂肪干細胞庫構建方法。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種脂肪干細胞庫構建方法，包括以下步驟：

（1）、采集脂肪：對供者進行HLA分型檢測、ABO/Rh血型檢測、人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV的檢測、梅毒螺旋體感染檢測，然后對符合要求的供者在無菌場所采集脂肪；

（2）、用含青霉素和鏈霉素的PBS反復沖洗脂肪組織，去除殘留的血液，將脂肪組織絞碎為0.5～1mm³的脂肪組織微塊；

（3）、收集脂肪組織微塊，在700g離心10min；

（4）、吸棄下層少量液體，將脂肪組織微塊用二甲基亞砜和血清替代品按照1:9的比例混合的凍存液重懸；

（5）、將重懸的脂肪組織微塊分裝到凍存管中，放入凍存盒，-80℃冰箱過夜，次日轉移到液氮保存；

（6）、按照供者HLA分型、ABO/Rh血型和性別進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即完成脂肪干細胞庫的構建。