[發明專利]奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條

無效

• 申請號: 201310674116.9
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號: CN103616514A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 劉平;何寶祥;黃云飛
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于奶牛乳房炎檢測技術領域，尤其涉及一種奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條。

背景技術

白色念珠菌（Candida?albicans）又稱白假絲酵母菌，是人和動物真菌性疾病中最常見、最主要的共患條件致病真菌之一。此菌侵入乳腺并在乳腺內繁殖，使得奶牛乳腺炎頻發，尤其會造成頑固性乳房炎的頻發，不但制約奶牛乳業的發展，而且嚴重影響原料奶的品質，給奶牛養殖業造成很大的經濟損失；同時，這也威脅著人類健康。雖然該菌診斷有傳統的病原微生物學分離鑒定、PCR以及TCTA顯色檢測等方法，但這些方法對技術要求較高，而且費時、不經濟。采取易于采樣、便于檢測疾病的手段對維護奶牛產后健康和奶牛場經濟效益至關重要，而建立準確、及時的診斷技術是控制白色念珠菌危害的基本前提。

膠體金免疫層析技術因其具有快速、便捷，不需要特殊設備，結果判斷直觀等優勢，越來越受到人們的重視。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種特異、準確、快速的奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條，包括吸水紙、分析膜、金標抗體結合墊、樣品墊和底板，分析膜含有用抗白色念珠菌單克隆抗體包被的檢測線（T）以及用羊抗兔IgG包被的質控線（C），金標抗體結合墊包被膠體金標記的白色念珠菌抗兔多克隆抗體。

抗白色念珠菌單克隆抗體是利用雜交融合技術篩選出白色念珠菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株而得；白色念珠菌抗兔多克隆抗體是應用白色念珠菌顆粒性抗原多次免疫新西蘭大白兔而得。

分析膜為硝酸纖維膜，金標抗體結合墊為玻璃纖維膜。

上述奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條的制備方法，包括以下步驟：

（1）制備白色念珠菌抗體

抗白色念珠菌單克隆抗體是采用乳化的白色念珠菌作為抗原，分階段多次免疫Balb/c小鼠，再進行細胞融合，篩選出陽性雜交細胞株后，制備腹水而得；白色念珠菌抗兔多克隆抗體是采用白色念珠菌作為抗原多次免疫新西蘭大白兔制備而得的高效價抗白色念珠菌多克隆抗體；

（2）制備分析膜

將步驟（1）制備的白色念珠菌單克隆抗體在硝酸纖維膜包被形成檢測線，羊抗兔IgG在硝酸纖維膜包被形成質控線，備用；

（3）制備金標抗體結合墊

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，并采用標記體系標記白色念珠菌抗兔多克隆抗體，將金標抗體在支持膜上固相化；

（4）組裝試紙條

將步驟（2）的分析膜、步驟（3）的金標抗體結合墊、吸水紙、樣品墊、底板組裝成膠體金快速檢測試紙條。

步驟（3）中的標記體系為：膠體金顆粒在20nm以下極其穩定，抗體蛋白與膠體金結合最適宜的pH值為8～9，最適結合膠體金的抗體蛋白量為20～40μg/mL，最佳穩定劑為10%PEG20000，最佳膠體金復合物緩沖液的組分為pH值為8～9的Tris–HCl緩沖液、1%BSA、0.5%PEG20000、10%蔗糖和2%Tween–20。

針對目前缺乏簡便、快捷、有效的奶牛乳房炎白色念珠菌檢測方法，發明人研制了奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條：首先通過免疫動物、細胞融合及ELISA檢測等技術制備抗白色念珠菌的單克隆抗體；采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金顆粒，標記白色念珠菌抗兔多克隆抗體作為膠體金墊；將點涂有抗白色念珠菌單克隆抗體和羊抗兔IgG的硝酸纖維素膜、膠體金墊、樣品墊及吸收墊組裝制成檢測乳房炎真菌病原—白色念珠菌的快速診斷試紙條。本發明應用于奶牛乳房炎病原的檢測，具有特導、準確、快速、操作簡單等特點，適于基層畜牧養殖、畜牧技術推廣和畜牧動物檢疫使用，對奶牛業發展將有深遠的影響。因此，本發明對快速診斷和有效治療乳房炎有著十分重要的意義。

本發明奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條具有以下優點：

（1）檢測快速，10-20min出結果。

（2）特異性好，該試紙條與大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌等病原菌均無交叉反應，與白色念珠菌的特異顯色高。

（3）靈敏度高，檢測靈敏度為10²cfu·mL^-1。

（4）穩定性好，4℃條件下保存30天后的試紙條穩定性依然較好。

（5）與PCR檢測法對比實驗中，試紙條的陽性符合率為86.67%（13/15），有2份未檢出，陰性符合率為90%（9/10）。

附圖說明