[發明專利]奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310673972.2
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號: CN103627812A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 何寶祥;陳亞明;杜向宏
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于奶牛乳房炎病原細菌檢測技術領域，尤其涉及一種奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒。

背景技術

快速檢測與鑒定奶牛乳汁中的病原菌是及時有效地控制與預防病原菌傳播的前提，這對奶牛和人類健康都具有重要意義。目前，病原細菌的檢測方法主要依靠常規的細菌學培養方法，一般需4～7d，操作繁瑣，費時耗力；有關病原細菌檢測的乳膠凝集法、免疫磁珠分離法、酶免疫測定方法、核酸雜交技術和PCR技術，因其特異性強、敏感性高、操作簡單、檢測快速等優點而被廣泛應用，但這些方法每次實驗通常只能檢測一種病原微生物。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏、準確的奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，適用于被無乳鏈球菌(S.agalactiae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)、大腸桿菌(Escherichia?coli)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus?cereus)污染的奶樣樣品的分析。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，包括由四對特異性引物構成的引物對組；四對特異性引物分別是鑒定無乳鏈球菌sip基因的引物對sip-F和sip-B，鑒定金黃色葡萄球菌Nuc基因的引物對Nuc-F和Nuc-B，鑒定大腸桿菌rrnB基因的引物對rrnB-F和rrnB-B，鑒定蠟樣芽孢桿菌HblA基因的引物對HblA-F和HblA-B；引物對sip-F和sip-B、引物對Nuc-F和Nuc-B、引物對rrnB-F和rrnB-B、引物對HblA-F和HblA-B的特異性引物分別具有序列表SEQ.ID.No.1和2、4和5、7和8、10和11的堿基序列。

上述奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，包括以下試液：

A試液：含10×PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs和四對特異性引物；

B試液：含無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的DNA,作為陽性對照；

C試液：去離子水，作為陰性對照。

A試液每管42μl，含10×PCR緩沖液5μl、2.5mM?MgCl₂5μl、2.5mmol/L的dNTPs?4μl、四對特異性引物包括：無乳鏈球菌上游和下游引物各2μl、金黃色葡萄球菌上游和下游引物各2μl、大腸桿菌上游和下游引物各2μl、蠟樣芽孢桿菌上游和下游引物各2μl，引物濃度均為10μmol/L，5U/μl?Taq酶0.5μl，去離子水11.5μl。

奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒的引物對組，包括四對特異性引物，分別是鑒定無乳鏈球菌sip基因的引物對sip-F和sip-B，鑒定金黃色葡萄球菌Nuc基因的引物對Nuc-F和Nuc-B，鑒定大腸桿菌rrnB基因的引物對rrnB-F和rrnB-B，鑒定蠟樣芽孢桿菌HblA基因的引物對HblA-F和HblA-B；引物對sip-F和sip-B、引物對Nuc-F和Nuc-B、引物對rrnB-F和rrnB-B、引物對HblA-F和HblA-B的特異性引物分別具有序列表SEQ.ID.No.1和2、4和5、7和8、10和11的堿基序列。

奶牛乳房炎病因比較復雜，影響因子較多，傳統的檢測方法無法對乳汁中難培養或不可培養的致病菌進行檢測，而且特異性不高、靈敏度低、操作煩瑣、耗時，實現有效的監測、預防非常困難。針對這些問題，發明人結合多重PCR擴增技術，研制了本發明的奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速檢測試劑盒，據此建立的多重PCR快速檢測方法，可實現一次性、快速檢測乳汁中的出多種奶牛乳房炎主要病原菌（包括無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌）的目的。