[發明專利]克隆蘋果BKI1基因和蘋果BKI1基因編碼區序列的方法

無效

• 申請號: 201310672331.5
• 申請日: 2013-12-07
• 公開（公告）號: CN103642822A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 馬躍;張志宏;閻忠業;呂天星;劉志;王冬梅;張景娥;王豐;張蕾;代紅艷;李賀;劉月學
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學;遼寧省果樹科學研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/10
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是蘋果BKI1基因和克隆蘋果BKI1基因編碼區全長序列的方法。

背景技術

油菜素內酯是一類對植物生長起調節作用的激素類物質，在調控植物莖的伸長、維管束分化、光合作用、育性以及植株對逆境的抵抗能力等方面起重要作用。

油菜素內酯不敏感受體1激酶抑制子1(Brassinosteroids-Insensitive?1?kinase?inhibitor?1，BKI1)，是富含亮氨酸的激酶，其作用是與油菜素內酯不敏感受體1（BRI1）生成二聚體，阻斷油菜素內酯信號轉導途徑。在擬南芥中過表達BKI1的轉基因植株表現為矮化。

蘋果是世界性果樹，其產量名列果品的前三名。我國是蘋果生產大國，栽培面積約2000萬畝，產量超過2985萬噸，面積和產量均居世界第一位。隨著蘋果產業的逐年擴大和集約化生產的需要，培養矮化新品種是目前蘋果產業的育種目標之一。

發明內容

本發明的目的是提供一種克隆蘋果BKI1（BRI1?kinase?inhibitor?1）基因及蘋果BKI1基因編碼區全長序列的方法。

本發明提供的蘋果BKI1基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

上述的蘋果BKI1基因，其編碼區序列如SEQ?ID?NO:2所示。

上述的蘋果BKI1基因，其編碼區序列的編碼氨基酸如SEQ?ID?NO:3所示。

上述的蘋果BKI1基因，所述的蘋果為“寒富”蘋果。

上述的蘋果BKI1基因的制備方法，包括如下步驟：

1）提取蘋果葉片中的總DNA；

2）提取蘋果葉片中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA；

3）分別以DNA及cDNA為模板，通過設計的特定引物，利用PCR方法擴增，得到PCR產物；

其中，所述的特定引物是：

上游引物P1:5’-ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’；

下游引物P2:5’-TCAAATCTCATGACTGACCA-3’；

PCR反應體系為：20μL體系：

PCR反應程序為：94℃?3min；94℃?30s，58℃?1min，72℃?1min，35個循環；72℃延伸10min。

3）PCR產物經回收、純化，克隆，測序得到DNA序列如SEQ?ID?NO:1所示的蘋果BKI1

基因序列，cDNA序列如SEQ?ID?NO:2所示的蘋果BKI1基因編碼區序列。

本發明的有益效果是：本發明通過PCR及RT-PCR方法，首次從‘寒富’蘋果中克隆了蘋果BKI1基因序列及其編碼區序列。本發明簡單、快捷的獲取了蘋果BKI1基因及其完整編碼區序列，填補了該基因在蘋果上的空白，為進一步研究該基因在蘋果上的功能奠定了基礎。本發明經一次PCR即獲得了基因全長序列，經一次RT-PCR即獲得了基因編碼區序列，相比較染色體步移和RACE技術而言，具有工作量小，成本低，效率高等優勢。通過實驗，將蘋果BKI1基因轉入煙草中，使其在煙草中表達，至轉基因煙草植株開花后調查其株高，發現轉基因煙草植株主干的伸長與對照相比，顯著受到了抑制，過量表達BKI1基因起到了矮化植株的功能。同樣，將蘋果BKI1基因轉入‘寒富’蘋果，使其在蘋果中過量表達，在大田培養4個月的轉基因蘋果與對照相比，表現顯著的矮化趨勢。因此，在煙草和蘋果中，過量表達BKI1基因起到了矮化植株的作用。

附圖說明

圖1是“寒富”蘋果BKI1基因全長序列的PCR擴增圖；

其中，1：清水對照；2：100bpMarker；3：BKI1基因DNA全長序列；4：BKI1基因cDNA全長序列。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。

一、提取蘋果葉片組織中的總DNA和總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA

1.組織采集

選取“寒富”蘋果幼嫩葉片，取約0.1g，放入液氮罐中用于提取總DNA及總RNA。

2.DNA的提取

將0.05-0.1g幼嫩的蘋果葉片快速置于液氮研碎，移入到1.5mL離心管中；

加入600μL預熱的2%?CTAB提取緩沖液（預熱前加入12μL?0.4%?β-巰基乙醇），于65℃水浴鍋中恒溫水浴30min；