[發明專利]大豆胚尖生長點轉化方法

無效

• 申請號: 201310670950.0
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103695463A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 王罡;季靜;鐘影;張旭強;曹越平;邱麗娟
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

技術領域

?本發明涉及一種利用針頭創傷大豆胚尖頂端的農桿菌介導的抽真空輔助轉化大豆的遺傳轉化方法，屬于大豆轉基因研究領域。

背景技術

大豆「Glycine??max?(L.)Merr.」原產我國，世界最大的油料作物,因為大豆不僅可糧用、油用和飼用,還是植物蛋白的主要來源,又是食品、飼料等多種加工工業的優質原料。然而在普通栽培過程中，其產量和品質易受各種病蟲害的影響。一直以來人們嘗試用基因工程手段改良大豆種質，使其抗逆性增強。現如今抗草甘膦轉基因大豆已經成為美國、阿根廷內種植面積較大的國家，全世界有200多個公司在觸手適應不同氣候和地區、不同生育期的抗草甘膦大豆品種。然而，在我國暫時還未得到推廣，就我國國情而言，培育出具有自主知識產權的轉基因大豆迫在眉睫。

然而，大豆遺傳轉化一直受到諸多因素的限制，自1984年大豆遺傳轉化的首次報道。近30年的研究，大豆遺傳轉化效率依舊沒有顯著提高。其限制原因主要集中在兩方面，一是大豆組織培養再生體系，現如今大豆再生體系分為器官發生途徑和體細胞胚發生途徑，二者普遍存在著再生率低、重復性差、基因型差異較大等問題，從而影響了后期遺傳轉化方面的工作；二，大豆遺傳轉化方面，遺傳轉化依賴良好的再生體系，同時大豆本身是一年生有性生殖植物，外源基因的嵌合體、穩定遺傳等問題嚴重影響了轉基因大豆的遺傳效率。目前，我國大豆轉化常用的外植體如子葉節、胚尖、下胚軸等，轉化方法為基因槍轟擊轉化法和農桿菌介導轉化法，然而二者均存在轉化周期長、轉化率第低、嵌合體嚴重等問題。

本研究取材方便、快捷，無需組織培養階段，無需嚴格滅菌，再生能力強、操作簡單、生長周期短，是良好的遺傳轉化受體系統，對大豆遺傳轉化研究有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種大豆胚尖生長點轉化方法，即利用針頭創傷大豆胚尖生長點，農桿菌介導，真空滲透輔助外源基因導入，帶一片子葉的胚尖改良轉化方法。其特征是利用萌發2~3天的大豆種子，去掉種皮、一片子葉及真葉，暴露生長點后，用蘸有農桿菌菌液的針頭輕輕的于生長點處刺劃幾下，利用農桿菌真空滲透法輔助侵染大豆胚尖，吸去表面菌液后，共培養至長出0.5mm芽時，接轉到營養土中培養，獲得92%的再生率，?F1代檢測轉化率為6%。

本發明主要技術方案如下：

1、農桿菌菌液制備

在超凈工作臺中，用無菌移液器從?LB?培養平板上挑取攜帶有目的基因質粒的農桿菌單菌落接種于含有抗生素的?LB或YEP液體培養基中，?28℃，200?r/min振蕩培養14-16小時，然后以1：50進行2次活化，培養至?OD600?=0.5~0.7左右，將菌液置于滅菌的離心管中，4000r/min?25℃離心10min收集菌體，重懸液重懸菌體，按1:10~1:20的比例濃縮菌體，制備好的工程菌液備用。

重懸液：1/2?MS+60?g/L蔗糖+100μmol/L?AS（乙酰丁香酮），pH5.5。

2、大豆外植體的獲得

?????挑取種皮完整、無病斑且干燥的成熟大豆種子，用氯酸鈉：濃鹽酸=10：1在樂扣杯中制造氯氣，滅菌4-6h，通風櫥中使氯氣散盡，于超凈工作臺中，在加有8mL無菌水的帶有2張濾紙的9cm平皿中放入15粒大豆種子。25-28℃黑暗環境中萌發2~3d?。

取胚根萌發至0.5~2cm的大豆種子，剝去種皮，沿遠種臍端將兩片子葉分開，小心去掉一片子葉和所有原葉，暴露胚尖頂端，自然條件下稍微晾干，用沾有農桿菌菌液的針頭頂端輕輕劃刺2~3下，然后將預處理好大豆胚尖放入制備好的農桿菌菌液中。

3、真空滲透輔助侵染與共培養

將預處理好的大豆胚尖放入預先制備好的工程菌液中，使菌液與大豆胚尖充分接觸，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8分鐘；將大豆胚尖取出，吸取表面菌液，放入滅好菌的帶有2層濾紙的平皿中，每皿放置8粒，加入2~3mL無菌水，25-28℃黑暗環境中暗培養；3天后，向平皿中加入5~10mL無菌水，25-28℃光照環境下培養，直至胚尖頂端伸長至0.5~1cm，此時真葉也開始出現。

按營養土：蛭石：珍珠巖=6：4：1比例混合土壤，將土裝入直徑5cm的黑色塑料軟質小花盆中，將幼苗種入花盆中，注意不能折斷大豆根部，充足澆水，光照培養至4-6?片葉片長出后，移栽至大田或大型花盆中，直至開花、接種后，收集種子。

4、篩選，PCR檢測