[發(fā)明專利]大豆胚尖生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310670950.0
• 申請(qǐng)日: 2013-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN103695463A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王罡;季靜;鐘影;張旭強(qiáng);曹越平;邱麗娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

1.大豆改良胚尖真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法，步驟包括：

（1）大豆外植體的獲得；

（2）農(nóng)桿菌菌液制備；

（3）真空滲透輔助侵染與共培養(yǎng)；

（4）轉(zhuǎn)化外植體再生；

（5）移栽、篩選；

（6）大豆外植體的獲得；其特征在于：

步驟（1）中，口杯氯氣滅菌法：用氯酸鈉：濃鹽酸=10：1，在樂(lè)扣杯中制造氯氣，滅菌4-6h；超凈工作臺(tái)中通風(fēng)使氯氣散盡后加適量無(wú)菌水，25-28℃黑暗環(huán)境中浸泡萌發(fā)12-15?h?；

步驟（1）中，取吸脹萌動(dòng)的大豆種子，在無(wú)菌濾紙上吸取多余水分，剝?nèi)シN皮，沿遠(yuǎn)種臍端將兩片子葉分開，去掉一片子葉和原葉，保留完整胚和另一片子葉，獲得帶一片子葉的胚尖外植體，將外植體胚尖向上豎直插入預(yù)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)24?h；

步驟（1）中，在超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌移液器從含卡那霉素50?mg/L?利福平霉素25?mg/L的?LB培養(yǎng)平板上吸取含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于含抗生素的LB?液體培養(yǎng)基，?28℃，?200?r/min振蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)，然后以1：10-20進(jìn)行2次活化，培養(yǎng)至?OD600?=?1.?0，將菌液置于滅菌的離心管中，4000r/min?25℃離心10min收集菌體，將菌體重懸于液體共培養(yǎng)基，調(diào)整OD600?=?0.?5?作為工程菌液備用；

步驟（3）中，將預(yù)培養(yǎng)?24?h?已轉(zhuǎn)綠的外植體從培養(yǎng)基中取出，加入預(yù)先制備好的工程菌液，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8分鐘，28℃黑暗環(huán)境下150?r/min振蕩侵染1?h?，棄去菌液，將外植體近軸面朝下置于固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，?26-28℃黑暗環(huán)境下共培養(yǎng)3?d。

2.16?h?/8?h(?L/D)?的光照條件下培養(yǎng)1d；

步驟（4）中，將外植體從培養(yǎng)基中取出，?用無(wú)菌水徹底沖洗干凈后種植于穴盤中，營(yíng)養(yǎng)土：蛭石：珍珠巖=2：2：1，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出4-6?片葉片后移栽至溫室中生長(zhǎng)；

步驟（5）中，當(dāng)小苗在土壤中長(zhǎng)出4-7片新葉，用除草劑150mg/L草甘膦涂抹葉片，篩選出有抗性的植株；采用CTAB法提取篩選為陽(yáng)性的植株的基因組DNA，進(jìn)行目的基因的PCR檢測(cè)，目的基因檢測(cè)的上下游引物序列分別為：上游：GCTGGCCATCGACGAGTTC，下游：GGCCAGGAAGTTCGGGAAG。

3.PCR反應(yīng)體系為1μL基因組DNA，2.5μL?10×PCR?buffer，2μL?dNTPs?(?2.5μM?)?，1.25U?LA?Taq?酶，?加水至25μL。

4.PCR?反應(yīng)程序：94℃：3?min：94℃?30s，55℃30?s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10?min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）所述預(yù)培養(yǎng)基配方為：MS?+?30g/L?蔗糖?+?1?mg/L?6-?BA?+?7?g/L瓊脂，?pH?5.?8。

6.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）所述預(yù)培養(yǎng)基配方為：LB?培養(yǎng)基:?10?g/L胰蛋白胨?+?5?g/L酵母提取物?+?10g/LNaCl，?pH7.?0，?固體LB培養(yǎng)基另加15?g/L。

7.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟?（3）所述預(yù)培養(yǎng)基配為：共培養(yǎng)培養(yǎng)基:?MS+?30?g/L蔗糖?+?1?mg/L?6-?BA?+?200?mol·L－1?乙酰丁香酮，?pH?5.?8，固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基另加7?g/L瓊脂。