[發明專利]重組酶基因bet作為一種大腸桿菌異源蛋白表達融合標簽的應用

有效

• 申請號: 201310669870.3
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN103667331A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 尚廣東;凌文;張青;駱希;楊瑤
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一種利用新型的融合標簽在大腸桿菌中表達異源蛋白的方法。

背景技術

異源基因在大腸桿菌（Escherichia?coli）中的表達以獲得足夠量和高活性的蛋白是蛋白質藥物、分子生物學以及生物化學研究的重要內容。獲得高活性蛋白的前提之一是在大腸桿菌內表達的蛋白分泌至細胞間質，即以可溶性的形式存在。可溶性的蛋白經超聲破碎后，即釋放至緩沖液中，隨后可通過親和層析等方法加以純化。可溶性的蛋白以正確的折疊形式存在而保持活性。然而許多蛋白，尤其是異源蛋白（如與大腸桿菌種屬差別較大的生物尤其是真核生物的基因）常以不可溶性的形式呈現。不可溶性的蛋白存在于包涵體內，其分離純化需要首先以強離子去污劑變性處理將蛋白從包涵體中釋放出來，再以還原劑進行復性，還需透析以去除離子。這種變性和復性的過程不僅僅煩瑣耗時，更不利的是損害蛋白的活性、降低蛋白的收率，并對后續的實驗產生不良的影響。

有許多方法以提高蛋白可溶性組份占總蛋白的比例，其中將目的蛋白和標簽蛋白的融合表達是提高目的蛋白可溶性組份的有效手段。已開發出了一系列融合表達標簽，如麥芽糖結合蛋白（mMBP）、小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)、翻譯起始因子（IF2-I）、氮源利用物質A（NusA）、谷胱甘肽轉移酶（GST）、伴侶蛋白GroEL、伴侶蛋白DnaK和啟動因子（TF）等。但目前的融合標簽種類還不足，由于蛋白的特殊性，沒有一種通用的融合標簽能解決提高所有的異源蛋白的可溶性問題。常常有目的基因難以實現可溶性表達的情形。因此開發新型的表達方式對蛋白質藥物的開發以及基礎研究均有著重要意義。

發明內容

為了解決現有技術手段的不足，提供更多的融合標簽用于目的蛋白的表達。

本發明公開了來源于lambda噬菌體的重組酶基因bet作為異源基因在大腸桿菌內進行蛋白表達的融合標簽的用途。

本發明構建了以來源于lambda噬菌體的重組酶基因bet作為異源基因在大腸桿菌內進行蛋白表達的融合標簽的融合蛋白表達載體。即將六個組氨酸序列、bet基因、煙草蝕刻病毒蛋白酶（TEV）酶切位點和一段填充片段等元件的核苷酸序列融合后，克隆至大腸桿菌表達載體pET30a(+)，獲得了bet基因融合表達載體pLS2723。待表達的目的基因可通過取代填充片段而與六個組氨酸標簽和bet基因在讀碼框內融合。重組克隆轉化大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)后，在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導下表達標簽蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。

在填充片段的5′端設計有NcoI和BamHI酶切位點，3′端保留原載體pET30a(+)上的HindIII、NotI和XhoI酶切位點。外源基因可以選擇5′端和3′端酶切位點來進行克隆。由于BsaI和AflIII與NcoI為同尾酶，BglII和BamHI為同尾酶，SaII和XhoI同尾酶，故如外源DNA片段中含有填充片段兩側的酶切位點，也可通過設計同尾酶的酶切位點進行克隆。所純化的蛋白的可利用6個組氨酸標簽以Ni-NTA樹脂親和層析進行分離純化，純化的蛋白可以使用專一性很強的TEV蛋白酶酶切使得目的蛋白和Beta標簽進行分離。高活性的TEV蛋白酶可以在實驗室自制，這就大大地降低了蛋白表達和純化的成本。此后，可再經過Ni-NTA樹脂親和層析，含6個組氨酸標簽的Beta標簽蛋白和Ni-NTA樹脂結合，而目的蛋白不結合而洗脫。

優選實施例中選擇的是來源于豬腎細胞的腎素結合蛋白基因pRnBP和來源于聚胞藻Synechocystis?sp.PCC6803的slr1975基因，這兩個基因單獨表達時不可溶性蛋白占總蛋白的比例極少。而與Beta的融合表達后，可溶性均得以大大提高。pRnBP和Slr1975的生物化學活性均為N-乙酰-D-葡萄糖胺2-異構酶，此酶是酶法催化合成抗流感引物扎那米韋的關鍵中間體，高表達量的酶將使得大規模和高產的酶法催化更加簡便和快捷。

蛋白表達應用領域廣泛，前景廣闊，本發明所述的載體可廣泛運用與目的基因的表達和通過目的蛋白的可溶性，可應用于工業化生產蛋白質藥物以及分子生物學、生物化學和遺傳學等基礎研究領域。

附圖說明

圖1是7624個堿基對的bet基因作為融合標簽的大腸桿菌蛋白表達載體pLS2723的質粒限制性酶切圖譜。其中：

219-235是T7啟動子序列；

310-327是編碼6個組氨酸位點的核苷酸序列；

328-1110是bet基因的開放閱讀框序列；