[發明專利]一種快速鑒別中間型高溫放線菌的特異PCR方法

有效

• 申請號: 201310667412.6
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號: CN103614485A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 程池;趙紀文;姚粟;信春暉;李輝;劉勇;張明娟
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院;山東扳倒井股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學鑒別領域，具體涉及中間型高溫放線菌的快速鑒別方法。

背景技術

中間型高溫放線菌（Thermoactinomyces?intermedius）最早由Kurup于1981年發現，屬于細菌域（Eubacteria）-厚壁菌門（Firmicutes）-芽孢桿菌綱（Bacilli）-芽孢桿菌目（Bacillales）-高溫放線菌科（Thermoactinomycetaceae）-高溫放線菌屬（Thermoactinomyces），常見于自然界的高溫環境，嗜高溫，能產生豐富的菌絲和內生孢子。

中間型高溫放線菌可生產耐熱、光穩定的亮氨酸脫氫酶和苯丙氨酸脫氫酶，在藥物工業上有重要的應用價值。近年來，芝麻香型白酒釀造微生物研究中發現中間型高溫放線菌為高溫大曲中的優勢菌種，其代謝產物對芝麻香型白酒特殊風味物質形成具有不可忽視的作用。因此，對高溫大曲等高溫環境中的中間型高溫放線菌菌株的篩選鑒別具有重要實踐意義。然而，中間型高溫放線菌與其近緣種之間在形態學特征、生理生化特征及16S?rRNA基因序列方面均十分接近，應用常規技術鑒別繁瑣費時，無法滿足中間型高溫放線菌的篩選及其應用研究的要求，因此，目前亟需建立一套準確，快速的中間型高溫放線菌鑒別方法，為菌種的選育及其應用研究提供技術支撐。

發明內容

本發明的目的是提供一種可以快速鑒別中間型高溫放線菌的方法。

為達到上述目的，本發明設計了中間型高溫放線菌的特異PCR引物，進行特異PCR擴增反應，可擴增出中間型高溫放線菌的特征持家基因，實際擴增片段為576bp。

用于鑒別中間型高溫放線菌的引物序列如下：

上游引物78F：5’-TTGTCCACGTGGTTGTCG-3’

下游引物618R：5’-TACGTCATCCCCGGTCAG-3’。

本發明采用的技術方案如下：

1)????????獲取菌種基因組DNA；

2)????????采用上述引物在PCR儀上進行PCR擴增；

PCR反應體系為50?μl，其中10×Taq?reaction?buffer?5.0?μL，引物（10μmol/L）各1.0?μl，10?μmol/L?的dNTP?4.0?μL，2.5U的Taq酶0.6?μL，DNA模板1.0?μL，dd?H₂O?37.4?μL。

PCR擴增的反應條件分別為：

78F/618R：95℃預變性5?min，進入循環：94℃變性30s，52℃復性30s，72℃延伸80s，共35個循環，然后72℃延伸10min。

3)????????PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測。

4)????????中間型高溫放線菌鑒別

????在紫外燈下查看電泳條帶，在576bp處有電泳條帶的菌株為中間型高溫放線菌，在576bp處均無條帶為其它種。

本發明經過充分的前期試驗篩選和優化，得到的引物特異性強，PCR擴增條件簡單，采用簡單PCR反應后，通過電泳檢測便可快速鑒別高溫放線菌屬菌種，具有高效、便捷及成本低廉等顯著優點。

附圖說明

圖1中間型高溫放線菌的特異性引物設計示意圖，其中有下劃線的部分為擴增片段對應的核苷酸序列，有下劃線的斜體加粗部分為所設計的引物特異性結合位點。?

圖2為引物78F/618R的PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜，

1-T.vulgaris?DSM?43016，2-T.vulgaris?ACCC?41061，3-T.vulgaris?ZM60，4-L.sacchari?DSM?43356，5-L.putidus?DSM44608，6-B.thuringiensis?CICC?22945，7-T.intermedius?DSM?43816，8-B.licheniformis?CICC?10101，9-L.tengchongensis?CCTCC?AA?208050，10-?L.sediminis?CCTCC?AA?2011024，11-Blank，M-DL2000?marker。

具體實施案例

下面結合實施案例對本發明進行具體說明，實施案例是為了進一步闡述本發明，而不會給本發明造成任何限制。

實施例一：特異性PCR引物的設計