[發明專利]重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑、其制備和應用

有效

• 申請號: 201310666859.1
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號: CN103690569B
• 公開（公告）日: 2016-11-02
• 發明（設計）人: 姜偉;朱長軍;董智雄
• 申請（專利權）人: 天津億海生物科技有限公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;C12N15/86;C12N15/113;A61P35/00
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種重組腺相關病毒制劑、其制備方法和應用。?

背景技術

全球乳腺癌發病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢。美國8名婦女一生中就會有1人忠乳腺癌。近年我國乳腺癌發病率的增長速度高出高發國家1～2個百分點。據國家癌癥中心和衛生部疾病預防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發病數據顯示：全國腫瘤登記地區乳腺癌發病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發病率(粗率)全國合計為42.55/10萬，城市為51.91/10萬，農村為23.12/10萬。近年來，乳腺腫瘤治療雖然取得一定進展，但整體效果欠佳，病死率仍居高不下，原因在于現階段人們根據對乳腺癌發生發展機制的認識和指定的癌癥治療方案仍欠缺特異性和高效性。大多數癌癥治療方案導致非特異性治療副作用的產生，對患者造成不同程度的傷害，甚至引起生命危險。因此，在我國經濟飛速發展、人民健康水平空前提高的情況下，對乳腺癌特異性治療的研究有了更大的社會需求，也是我國持續發展和建設和諧社會的重要任務之一。?

目前，分子靶向藥物是抗腫瘤新藥研發的主要方向。但是，腫瘤的靶向治療面臨巨大挑戰，主要是缺乏特異性殺傷腫瘤細胞的有效藥物靶點。為解決這個難題，必須系統地理解腫瘤發生發展調控的相關機制，找出可以作為藥物靶點的重要調控分子，實行特異性殺傷腫瘤治療方案。所以，推動特異性靶點抗腫瘤新藥研發，不僅是癌癥患者的殷切希望，也是我國獨立知識產權抗癌新藥研發、民族制藥產業發展和國家經濟進一步騰飛的迫切需要。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種可以進行乳腺腫瘤治療和抑制的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑。?

真核細胞內DNA合成蛋白因子Cdc6對細胞S期起始DNA復制至關重要。抑制細胞內Cdc6的表達，導致特異性S期腫瘤細胞死亡，而正常細胞僅發生周期阻滯。間歇性抑制細胞內Cdc6基因表達，最終導致所有腫瘤細胞死亡，相反不影響正常細胞的生?長。因此，DNA合成蛋白因子Cdc6可以作為特異性抗腫瘤治療的靶標。?

腺相關病毒(AAV)具有自然缺陷、無包被和無致病原性，它能整合其基因組到19號染色體的一個特別位點并保持整合狀態。AAV的位點特異性的整合能力、其自然缺陷以及其無致病原性使其成為基因治療載體成為可能。在基因復制條件下AAV能復制產生子代病毒顆粒。因此我們將特異靶向Cdc6基因的小分子干擾RNA(siRNA)插入AAV的特異位點，利用其復制特性，使AAV感染的細胞持續產生Cdc6siRNA。?

在此基礎上，本發明提供一種重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑，其含有重組腺相關病毒AAV-shCdc6；所述重組腺相關病毒AAV-shCdc6是將特異性人Cdc6RNAi靶向序列的小分子干擾RNA(siRNA)插入AAV的特異位點后得到的。所述特異性人Cdc6RNAi靶向序列如SEQ?ID?NO.1所示。所述制劑中重組腺相關病毒AAV-shCdc6可以經濃縮后得到任意滴度的病毒液。優選病毒滴度為每毫升5×10¹³。?

本發明的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑的制備方法，包括以下步驟：?

(1)確定人Cdc6siRNA靶向序列第1091至1110堿基；?

(2)化學合成引物；?

(3)上述引物退火后，連接入腺病毒載體pAAV-GFP，得到pAAV-GFP-shCdc6；?

(4)應用pAAV-GFP-shCdc6和輔助載體質粒pAAV-RC2和pHelper共轉染293T細胞；?

(5)細胞培養2天后，收集細胞培養上清，以1：100比例稀釋再次感染293T細胞；?

(6)細胞培養2天后，收集細胞培養上清，離心收集病毒濃縮液。?

所述步驟(1)中的人Cdc6siRNA靶向序列第1091至1110堿基如SEQ?ID?NO.1所示。?

所述步驟(2)中的引物優選為：?

引物1：5’-GATTC?gagatcaggttctggacaaA-3’，如SEQ?ID?NO.2所示；?

引物2：5'-AGCTTttgtccagaacctgatctcG-3’，如SEQ?ID?NO.3所示。?