[發明專利]金黃色葡萄球菌HI重組蛋白的發酵和純化工藝

有效

• 申請號: 201310664256.8
• 申請日: 2013-12-09
• 公開（公告）號: CN103695508A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 敬海明;董衍東;劉唯;鄒全明;曾浩;章金勇;吳翼
• 申請（專利權）人: 重慶原倫生物科技有限公司;中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K19/00;C07K1/22;C07K1/18;C12R1/19
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標代理有限公司 11012
• 代理人: 黃澤雄;陳悅軍

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種制備金黃色葡萄球菌（SA）HI重組蛋白的發酵工藝和純化工藝。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus，SA)，以下簡稱金葡菌，有“嗜肉菌”的別稱。作為革蘭氏陽性菌的代表，它是引起醫院感染和社區感染的一種重要致病菌。感染以急性、化膿性為特征，局部感染可引起皮膚和軟組織等的化膿性感染，經久不愈；全身感染可導致骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、肺炎、膿毒血癥等嚴重感染及并發癥，死亡率高達20％。同時，金葡菌的外毒素還可引起食物中毒、燙傷樣皮膚綜合征和中毒性休克綜合征等全身致死性感染。因此，加強對金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗將對有效控制金葡菌耐藥性蔓延和臨床金葡菌廣泛感染具有重要的戰略及現實意義。

本申請發明人前期構建了一種金黃色葡萄球菌重組蛋白HI，由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌α-溶血素無毒突變體與鐵離子表面決定蛋白活性片段重組而成，并對該蛋白提交了中國專利申請（CN102993308A），該申請全部通過引用的方式結合至本文。

發明內容

本申請在上述內容的基礎上，進一步提供所述HI重組蛋白基因工程菌的發酵、純化及去內毒素工藝。

在本申請中，HI蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

在第一個方面，本發明提供HI重組蛋白基因工程菌的發酵工藝，包括將一定量的種子菌接種于含有甘油和一定溶氧量的培養基中，經誘導劑誘導一定時間而表達重組蛋白。

優選地，所述工藝涉及培養基、種子菌接種量、培養基中的甘油量、溶氧量、誘導劑種類、誘導劑濃度、誘導溫度及誘導時間幾方面因素對大規模、高密度地生產HI重組蛋白基因工程菌的影響。

進一步優選地，所述培養基可以是動物源性TB、動物源性M9、植物源性TB、植物源性M9，優選為動物源性TB；所述種子菌的接種量是5%～15%，優選為10%；所述甘油量為5-15ml/L培養基，優選為10ml/L培養基；所述溶氧量是25%～65%，優選為45%；所述誘導劑可以是乳糖或IPTG，優選為IPTG；所述誘導劑的濃度是0.1～1mM，優選為0.2mM；所述誘導溫度為16～37℃，優選為30℃；所述誘導時間為1～6小時，優選為5小時。

在所述發酵工藝的一種具體實施方式中，基礎培養基選用動物源性TB培養基，其中甘油量是10ml/L；發酵開始時，種子菌的接種量比例是10%；在發酵過程中溶氧濃度保持在45%；誘導時，溫度調為30℃、IPTG濃度為0.2mM、誘導5h。

本領域技術人員應當理解，所述種子菌是含有能夠表達HI蛋白的載體的大腸桿菌；優選地，所述大腸桿菌是XL-1Blue；所述載體是pGEX-6p-2。根據CN102993308A以及本申請記載的內容，本領域技術人員可以知道如何制備本發明所需要的HI生產種子菌。

在第二方面，本發明還提供一種HI重組蛋白基因工程菌發酵后的蛋白純化工藝，包括依次進行的GST-瓊脂糖凝膠4B親和層析、陽離子交換層析、置換緩沖液及去內毒素。

優選地，所述陽離子交換層析使用MMC層析柱，使用的緩沖液為，緩沖液A:25mMNaAC-HAc，pH4.5，緩沖液B:50mM?PB+1M?NH₄Cl，pH7.0；上樣流速為4.7ml/min，洗脫流速：4.7ml/min；洗脫程序：0-100%B，20個柱體積（CV）；優選地，上樣pH值為7.0-7.5，洗脫pH值為11.0。

優選地，所述置換緩沖液使用G25層析柱；使用緩沖液為疫苗稀釋液。

優選地，去內毒素使用Q?HP層析柱；使用緩沖液為，緩沖液A：疫苗稀釋液；緩沖液B：1M?NaOH；

在優選實施方案中，進行親和層析之前，需要對基因工程菌進行菌體破碎，以將蛋白從菌體中釋放出來。

本發明提供的發酵工藝能夠大規模、高密度地生產HI重組蛋白基因工程菌體；本發明提供的純化工藝針對HI重組蛋白的蛋白特性，能夠高效地獲得得率高、純度好的精制蛋白原液。

附圖說明

圖1、工程菌pGEX-6P-2-HI/XL1-Blue細菌在四種培養基中的生長曲線。

圖2、HI重組蛋白在M9和TB培養基中的表達情況。1：蛋白質分子量標準；2：M9；3：TB。

圖3、不同IPTG濃度對HI重組蛋白表達的影響。1：蛋白質分子量標準；2：0.1mM；3：0.2mM；4：0.5mM；5：1mM。