[發(fā)明專利]一種利用細(xì)菌膜脂構(gòu)建模擬細(xì)胞膜快速篩選抗菌肽的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310664134.9
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103642896A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張暉;唐文婷;齊希光;王立;錢海峰
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用細(xì)菌膜脂構(gòu)建模擬細(xì)胞膜快速篩選抗菌肽的方法，其特征在于以細(xì)菌膜脂構(gòu)建模擬細(xì)胞膜親和固定相，再將蛋白進(jìn)行雙酶復(fù)合酶解，最后采用模擬細(xì)胞膜親和吸附及高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)快速篩選鑒定抗菌肽，具體工藝如下：

(1)將經(jīng)三代試管斜面活化培養(yǎng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，離心棄培養(yǎng)基取得菌體，無菌水清洗菌體數(shù)次以除去殘留培養(yǎng)基；

(2)將步驟(2)中得到的菌體，重懸于Tris-HCl緩沖液(25mM，pH7.5)中，向此菌懸液中加入氯仿-甲醇(1∶2，V／V)混合溶液，室溫下攪拌60～90min后，依次加入等體積氯仿和無菌水，繼續(xù)攪拌20min～30min，收集氯仿提取物，旋蒸除去氯仿，通氮氣除去殘留溶劑，得到細(xì)菌細(xì)胞膜脂；

(3)硅膠在20％HCl中回流6～10h，用去離子水洗至中性，110～120℃干燥，制得活化硅膠；

(4)將步驟(2)中得到的細(xì)菌細(xì)胞膜脂溶于氯仿／甲醇(19∶1，v／v)中，將步驟(3)中得到的活化硅膠加入到上述溶液中，4℃振搖30～60min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，通氮氣除去殘留溶劑，細(xì)胞膜脂即包覆在硅膠表面形成干的細(xì)胞膜脂薄膜，將其用pH7.2的10mM磷酸鹽緩沖液溶脹6h～10h，細(xì)胞膜脂自發(fā)形成模擬細(xì)胞膜脂質(zhì)體，上清液離心去除，用磷酸鹽緩沖液洗滌包裹有模擬細(xì)胞膜的硅膠，至洗滌液中無磷檢出為止，離心沉降物即為細(xì)菌膜脂源模擬細(xì)胞膜親和固定相；

(5)將蛋白以兩種蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解，控制料液比1∶8～1∶20，37～60℃下調(diào)節(jié)pH2.0～9.0，酶解結(jié)束后，調(diào)回pH到6.8～7.0，100℃煮沸滅酶10min，隨后將其快速冷卻至室溫；

(6)將步驟(5)中所得蛋白酶解液進(jìn)行離心操作，離心條件為：溫度4～25℃，時間10～15min，轉(zhuǎn)速8000～12000r，離心結(jié)束后，取上清液，經(jīng)100Da透析袋透析，再將其置于預(yù)冷溫度為-86℃超低溫冰箱中預(yù)凍，預(yù)凍時間為2～6h，隨后進(jìn)行真空冷凍干燥，設(shè)置參數(shù)為-55～-45℃，壓力0.03～0.2mBar，凍干時間為48～72h，凍干粉配成等濃度溶液進(jìn)行抗菌試驗，取抗菌能力最好的組分-20℃保存留用；

(7)將步驟(4)中得到模擬細(xì)胞膜親和固定相和抗菌能力最強(qiáng)的蛋白酶解物組分混合置于2～50ml離心管中，25～37℃下保溫孵育30～120min，離心后留取上清液，沉淀用緩沖液淋洗6～10次，保留洗滌液，合并洗滌液和上清液，并命名為模擬細(xì)胞膜吸附后流出液，利用高效液相-質(zhì)譜技術(shù)檢測抗菌能力最強(qiáng)的蛋白酶解物組分和模擬細(xì)胞膜吸附后流出液的指紋圖譜，純化制備消失或峰面積減小的差異峰，并對其進(jìn)行抗菌能力驗證和肽序分析，制備得到的差異峰即為抗菌肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用細(xì)菌膜脂構(gòu)建的模擬細(xì)胞膜快速篩選抗菌肽的方法，其特征在于：模擬細(xì)胞膜系采用真實細(xì)菌的細(xì)胞膜脂構(gòu)建，所用細(xì)菌是大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌中的一種。