[發明專利]一種利用細菌膜脂構建模擬細胞膜快速篩選抗菌肽的方法

無效

• 申請號: 201310664134.9
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103642896A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 張暉;唐文婷;齊希光;王立;錢海峰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物活性肽的制備純化領域，涉及一種利用來源于細菌細胞膜脂的模擬細胞膜親和吸附聯用質譜技術快速篩選抗菌肽的工藝，能夠實現抗菌肽的靶向性快速篩選及分離鑒定，達到了提高抗菌肽分離純化效率的目的。

背景技術

抗生素在世界范圍內的持續使用已造成了多種抗性菌株的產生，成為全球公共衛生問題。抗菌肽以微生物的細胞膜為靶目標，引起細胞膜的裂解從而導致細胞死亡，具有廣譜抗菌活性，且不易產生耐藥性，可用于醫藥、食品、飼料加工業等領域，具有極大的開發應用前景。而目前在抗菌肽的生產方面存在一些問題：直接提取工藝繁瑣，成本昂貴，且天然資源有限；化學合成法成本太高，產業化不易實現，同時難以保證合成肽類的生物活性；基因工程方法雖然使獲得大量、廉價抗菌肽成為可能，但在實際操作中發現其獲得的抗菌肽因空間結構上的差異而導致抗菌能力較弱，常用的細菌表達體系表達產量不高等缺點，因此，如何實現抗菌肽的高通量篩選，是抗菌肽生產和應用亟待解決的問題。

大多數已知的抗菌肽發揮其殺菌、抑菌作用的首要步驟均是與細菌細胞膜的吸附結合，通過其疏水性殘基與細菌細胞膜的脂質雙分子層相互作用，即抗菌肽與細菌細胞膜間同樣存在著特異性的親和作用。已有基于高效液相色譜、細胞生物學與受體藥理學的原理，利用模擬細胞膜(Mimic?cell?Membrane，MCM)研究抗菌肽與膜受體相互作用的相關報道，因此將模擬細胞膜應用于抗菌肽的快速、高效篩選理論上是可行的。

目前最常見的模擬細胞膜是由單一或有限種類的磷脂或磷脂類似物制備而成。因其能在水中自發形成模擬真實生物膜的脂雙層結構，且具備生物膜的流動性特征，同時克服了真實細胞膜在操作過程中易失活的缺點，因此一直以來被研究者用作真實細胞膜的常用模型。然而抗菌肽在發揮作用的過程中，其吸附結合的真實細菌細胞膜中的磷脂構成、含量、電荷狀態等遠比目前廣泛應用的模擬細胞膜復雜得多。基于真實細菌細胞膜的復雜性，可將其膜脂組分提取出來，在離體條件下將其組裝成模擬膜。采用來源于真實細菌的細胞膜脂構建的模擬細胞膜可更加真實的反應抗菌肽與細菌細胞膜脂之間的相互作用，同時克服了真實細胞膜在操作過程中易失活的缺點。目前，國內外尚未見采用來源于細菌的細胞膜脂構建的模擬細胞膜來篩選抗菌的肽相關文獻報道。

本專利基于模擬細胞膜與抗菌肽的作用原理，采用細菌細胞膜脂構建模擬細胞膜固定相和色譜柱，同時結合質譜技術快速篩選抗菌肽。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用細菌膜脂構建模擬細胞膜快速篩選抗菌肽的工藝，包括如下步驟：

(1)將經三代試管斜面活化培養的細菌轉接入液體培養基中培養至對數期，離心棄培養基取得菌體，無菌水清洗菌體數次以除去殘留培養基；

(2)將步驟(2)中得到的菌體，重懸于Tris-HCl緩沖液(25mM，pH7.5)中，向此菌懸液中加入氯仿-甲醇(1∶2，V／V)混合溶液，室溫下攪拌60～90min后，依次加入等體積氯仿和無菌水，繼續攪拌20min～30min，收集氯仿提取物，旋蒸除去氯仿，通氮氣除去殘留溶劑，得到細菌細胞膜脂；

(3)硅膠在20％HCl中回流6～10h，用去離子水洗至中性，110～120℃干燥，制得活化硅膠；

(4)將步驟(2)中得到的細菌細胞膜脂溶于氯仿／甲醇(19∶1，v／v)中，將步驟(3)中得到的活化硅膠加入到上述溶液中，4℃振搖30～60min，旋轉蒸發除去溶劑，通氮氣除去殘留溶劑，細胞膜脂即包覆在硅膠表面形成干的細胞膜脂薄膜，將其用pH7.2的10mM磷酸鹽緩沖液溶脹6h～10h，細胞膜脂自發形成模擬細胞膜脂質體，上清液離心去除，用磷酸鹽緩沖液洗滌包裹有模擬細胞膜的硅膠，至洗滌液中無磷檢出為止，離心沉降物即為細菌膜脂源模擬細胞膜親和固定相；

(5)將蛋白以兩種蛋白酶進行復合酶解，控制料液比1∶8～1∶20，37～60℃下調節pH2.0～9.0，水解結束后，調回pH到6.8～7.0，100℃煮沸滅酶10min，隨后將其快速冷卻至室溫；

(6)將步驟(5)中所得蛋白酶解液進行離心操作，離心條件為：溫度4～25℃，時間10～15min，轉速8000～12000r，離心結束后，取上清液，經100Da透析袋透析，再將其置于預冷溫度為-86℃超低溫冰箱中預凍，預凍時間為2～6h，隨后進行真空冷凍干燥，設置參數為-55～-45℃，壓力0.03～0.2mBar，凍干時間為48～72h，凍干粉配成等濃度溶液進行抗菌試驗，取抗菌能力最好的組分-20℃保存留用；