[發(fā)明專利]一種定量檢測人α-乳白蛋白含量的方法以及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310662702.1
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103642895A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設計）人: 任一平;陳啟;黃燾;賴世云;張京順
• 申請（專利權）人: 浙江貝因美科工貿股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵;馮瓊

1.一種定量檢測人α-乳白蛋白含量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1、將待測母乳樣品用50mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋，取10μL稀釋母乳樣品，然后加入20μmol/L同位素內標物溶液10μL、50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氫銨溶液945μL進行反應，反應后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗處靜置，然后加入200μg/mL牛胰蛋白酶溶液10μL酶解，加入5μL純甲酸后用高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜檢測，以內標法獲得人α-乳白蛋白特異肽和同位素特異肽的峰面積比；

步驟2、取梯度濃度的人α-乳白蛋白特異肽標準品溶液各10μL，分別加入20μmol/L同位素特異肽標準品溶液10μL，50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氫銨溶液955μL進行反應，反應后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗處靜置，加入5μL純甲酸后用高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜檢測，獲得人α-乳白蛋白特異肽和同位素特異肽的峰面積比與對應的人α-乳白蛋白特異肽標準品溶液濃度的標準曲線，將步驟1得到的人α-乳白蛋白特異肽和同位素特異肽的峰面積比代入標準曲線獲得母乳樣品中人α-乳白蛋白特異肽的濃度，然后按下式計算獲得人α-乳白蛋白含量；

人α-乳白蛋白含量=母乳樣品中α-乳白蛋白特異肽摩爾濃度×人α-乳白蛋白摩爾質量×母乳樣品稀釋倍數(shù)；

其中，所述同位素內標物為如SEQ?ID?NO:1所示序列的多肽且從N段起第12位和第13位的亮氨酸被碳氮全同位素標記，所述人α-乳白蛋白特異肽標準品和同位素特異肽標準品蛋白質序列均為如SEQ?ID?NO:2所示序列的多肽，且同位素特異肽標準品序列從N段起第6位和第7位的亮氨酸被碳氮全同位素標記。

2.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述待測母乳樣品用50mmol/L碳酸氫銨溶液按體積比1:9稀釋。

3.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述牛胰蛋白酶溶液由鹽酸和牛胰蛋白酶配制而成，所述牛胰蛋白酶比活>3000unit/mg?protein。

4.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述酶解為在37℃恒溫酶解2h。

5.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述梯度濃度的人α-乳白蛋白特異肽標準品溶液按照以下方法配制：

分別取1mmol/L人α-乳白蛋白特異肽溶液1μL、10μL、20μL、30μL、40μL和50μL，加碳酸氫銨溶液至1mL。

6.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述高效液相色譜分離條件：

色譜柱為C18色譜柱，柱溫為40℃；流動相A為體積百分比為0.1%的甲酸的乙腈溶液，流動相B為體積百分比為0.1%的甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.3mL/min。

7.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述三重四級桿質譜檢測條件為：

毛細管電壓：3.5kv，錐孔電壓：35kv，脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：900L/min，錐孔反吹氣流量：30L/hr，碰撞室壓力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，離子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，離子能量2：1.0；離子源溫度：150℃，提取器電壓：3.0V，入口透鏡電壓：0.5V，出口電壓：0.5V，碰撞梯度：1.0。

8.一種定量檢測人α-乳白蛋白含量的試劑盒，其特征在于，包括同位素內標物、人α-乳白蛋白特異肽標準品、同位素特異肽標準品；

所述同位素內標物為如SEQ?ID?NO:1所示序列的多肽且從N段起第12位和第13位的亮氨酸被碳氮全同位素標記，所述人α-乳白蛋白特異肽標準品和同位素特異肽標準品蛋白質序列均為如SEQ?ID?NO:2所示序列的多肽，且同位素特異肽標準品序列從N段起第6位和第7位的亮氨酸被碳氮全同位素標記。

9.根據(jù)權利要求8所述試劑盒，其特征在于，包括同位素內標物溶液、人α-乳白蛋白特異肽標準品溶液、同位素特異肽標準品溶液、二硫蘇糖醇溶液、碳酸氫銨溶液、碘代乙酰胺溶液、牛胰蛋白酶溶液和純甲酸。

10.根據(jù)權利要求9所述試劑盒，其特征在于，各組分濃度如下：

20μmol/L同位素內標物溶液、1mmol/L人α-乳白蛋白特異肽標準品溶液、20μmol/L同位素特異肽標準品溶液、50mmol/L二硫蘇糖醇溶液、50mmol/L碳酸氫銨溶液、150mmol/L碘代乙酰胺溶液、200μg/mL牛胰蛋白酶溶液、純甲酸。