[發明專利]一種定量檢測人α-乳白蛋白含量的方法以及試劑盒

有效

• 申請號: 201310662702.1
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103642895A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 任一平;陳啟;黃燾;賴世云;張京順
• 申請（專利權）人: 浙江貝因美科工貿股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵;馮瓊

技術領域

本發明涉及分析化學領域，更具體的說是涉及一種定量檢測人α-乳白蛋白含量的方法以及試劑盒。

背景技術

早在上世紀80年代，母乳喂養的優點已被世界上很多學術機構發現，并且有很多論文證實了其優越性。母乳給嬰兒提供了均衡的蛋白質，脂肪，碳水化合物，礦物質和維生素，使嬰兒能夠健康成長。

現代社會中，嬰兒由于種種原因無法完全使用母乳喂養，只能部分或者完全用牛乳來替代母乳喂養。牛乳中的營養物質組成與母乳有很大區別。例如每100mL牛乳中含3.4g蛋白質，其中約80%蛋白質為酪蛋白，剩下的20%為乳清蛋白；而母乳中的這三個數值分別為1.1g、40%以及60%。酪蛋白進入嬰兒胃中會凝結成塊，不利于吸收；而乳清蛋白則不會出現此類現象，其在嬰兒體內的吸收利用效率遠遠大于酪蛋白。牛乳中的乳清蛋白不僅含量低于母乳，而且其組成部分也有所區別：牛乳清蛋白主要由α-乳白蛋白與β-乳球蛋白構成，而母乳中主要含有α-乳白蛋白，不含有β-乳球蛋白。為了研制更接近母乳的配方奶粉，一般都會向牛乳中添加符合母乳比例的α-乳白蛋白。

母乳中的營養物質含量在個體之間變化很大，主要受母親身體狀況、飲食、哺乳階段、氣候、哺乳方式等因素影響。為了更精確地向配方奶粉中添加α-乳白蛋白，以適合各個成長階段嬰兒的營養需求，需要對各種階段、條件下的母乳中的α-乳白蛋白進行準確定量檢測，其中的關鍵即是建立準確定量檢測人α-乳白蛋白的檢測方法。

國內外蛋白質的定量檢測方法主要有液相色譜法、毛細管電泳法、凝膠分子體積排阻色譜以及酶聯免疫法等方法。前三類方法均采用了紫外檢測器，但是和人α-乳白蛋白吸收光波長相接近的干擾蛋白很多，導致其檢測靈敏度低，選擇性低，不適宜用于定量檢測母乳這樣基質復雜，蛋白質種類多的樣品。酶聯免疫利用抗原抗體特異性結合能力對蛋白質進行檢測。由于缺乏標準品，以及抗體對其他母乳蛋白質的交叉反應，使得酶聯免疫法也無法應用于母乳蛋白質的準確定量檢測。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種定量檢測人α-乳白蛋白含量的方法以及試劑盒，使得所述方法能夠準確定量檢測母乳中α-乳白蛋白含量，使得所述方法的靈敏度、精密度和基質效應符合現有標準。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種定量檢測人α-乳白蛋白含量的方法，包括如下步驟：

步驟1、將待測母乳樣品用50mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋，取10μL稀釋母乳樣品，然后加入20μmol/L同位素內標物溶液10μL、50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氫銨溶液945μL進行反應，反應后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗處靜置，然后加入200μg/mL牛胰蛋白酶溶液10μL酶解，加入5μL純甲酸后用高效液相色譜串聯三重四級桿質譜檢測，以內標法獲得人α-乳白蛋白特異肽和同位素特異肽的峰面積比；

步驟2、取梯度濃度的人α-乳白蛋白特異肽標準品溶液各10μL，分別加入20μmol/L同位素特異肽標準品溶液10μL，50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氫銨溶液955μL進行反應，反應后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗處靜置，加入5μL純甲酸后用高效液相色譜串聯三重四級桿質譜檢測，獲得人α-乳白蛋白特異肽和同位素特異肽的峰面積比與對應的人α-乳白蛋白特異肽標準品溶液濃度的標準曲線，將步驟1得到的人α-乳白蛋白特異肽和同位素特異肽的峰面積比代入標準曲線獲得母乳樣品中人α-乳白蛋白特異肽的濃度，然后按下式計算獲得人α-乳白蛋白含量；

人α-乳白蛋白含量=母乳樣品中α-乳白蛋白特異肽摩爾濃度×人α-乳白蛋白摩爾質量×母乳樣品稀釋倍數；

其中，所述同位素內標物為如SEQ?ID?NO:1所示序列的多肽且從N段起第12位和第13位的亮氨酸被碳氮全同位素標記，如下：

AKQFTKCELSQL*L*KDIDGYGGIA，其中*表示為碳氮全同位素標記；

所述人α-乳白蛋白特異肽標準品和同位素特異肽標準品蛋白質序列均為如SEQ?ID?NO:2所示序列的多肽，且同位素特異肽標準品序列從N段起第6位和第7位的亮氨酸被碳氮全同位素標記。如下：

CELSQLLK；

CELSQL*L*K，其中*表示為碳氮全同位素標記。