[發(fā)明專利]雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310660009.0
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN104694488A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周生;鄒劍敏;戴有理;戴亞斌;唐夢君;陳連頤;許明;姜逸;趙寶華;程旭
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省家禽科學(xué)研究所;周生
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/09;C12N15/50;C12R1/93
• 代理公司: 北京連和連知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11278
• 代理人: 奚衡寶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù)，產(chǎn)生一種雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ，用于制造疫苗。?

背景技術(shù)

傳染性支氣管炎(infectious?bronchitis,?IB)，為國際獸醫(yī)局規(guī)定的家禽二類傳染病之一，是由傳染性支氣管炎病毒(infectious?bronchitis?virus,?IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，對養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重制約著世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[Cavanagh?D.?Coronaviruses?in?poultry?and?other?birds.?Avian?Pathol,?2005,?34(6):?439-448.]。雖然疫苗在疾病的控制上發(fā)揮重要的作用，但隨著不同病變類型和組織嗜性毒株的不斷出現(xiàn),采用傳統(tǒng)方法研制的疫苗已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足IB防控的需求，以現(xiàn)代基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)，研制安全、高效的新型疫苗成為國內(nèi)外發(fā)展的必然趨勢。?

IBV屬于冠狀病毒科的Gamma冠狀病毒，是有囊膜不分節(jié)段單股正鏈RNA病毒，基因組長約27.6kb，具有典型的5′帽子和3′PolyA尾巴結(jié)構(gòu)，至少有10個明顯的開放閱讀框（ORF），分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其5′端2/3基因組編碼具有活性的復(fù)制酶，3′端1/3基因組主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白，如纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)、小膜蛋白(E)。其中S蛋白構(gòu)成了IBV的最表層纖狀突起，決定病毒的組織嗜性，但并不是IBV毒力的唯一決定性因素。N蛋白是IBV病毒內(nèi)部核衣殼的組成蛋白，在病毒復(fù)制、組裝中有作用，蛋白的磷酸化對其功能的發(fā)揮具有重要作用。3a和1b、5a和5b均為病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，在IBV感染細(xì)胞內(nèi)均可檢測到，但其功能目前還不清楚[Brian?DA,?Baric?RS.?Coronavirus?genome?structure?and?replication.?Curr?Top?Microbiol?Immunol，2005，287:?1-30.]。?

IBV?RNA基因組因具有獨特的先導(dǎo)引物轉(zhuǎn)錄機制，具有很高的錯配率。在免疫接種程序、家禽密度等因素的影響下，IBV正以不同的速度和不同的進化方向發(fā)生變異。目前世界上已分離的主要流行株有M41株、Conn株、澳大利亞T株、Hotle株、Gray株等，不同毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在著很大差異[劉勝旺.我國雞傳染性支氣管炎流行現(xiàn)狀及原因分析.中國家禽,2010,(16):?5-9.]。疫苗接種是預(yù)防IB的重要手段，相繼研制出常規(guī)的IB活苗和滅活苗，其中雞胚適應(yīng)毒H120和H52弱毒苗已被世界各國廣泛應(yīng)用。由于不同血清型IBV毒株之間交叉保護力弱，這給IB的免疫預(yù)防帶來了很大的困難。常規(guī)單一毒株疫苗常有免疫失敗的報道，弱毒疫苗還存在重組、毒力返強等問題。針對IBV新的流行情況研制有效的新疫苗迫在眉睫。?

反向遺傳操作技術(shù)(reverse?genetics)，即病毒的全長感染性cDNA克隆技術(shù)，包括病毒基因組全長cDNA克隆構(gòu)建技術(shù)和由cDNA轉(zhuǎn)錄病毒RNA的感染性轉(zhuǎn)錄本制備技術(shù)，能在病毒DNA水平上對其進行人工操作，解決了RNA病毒基因組難以操作的難題，從而為RNA病毒的基因復(fù)制與表達調(diào)控機理研究、新疫苗的研制等提供了強有力的手段。IB病毒的基因組是目前已知RNA病毒中最大的一類病毒，其反向遺傳操作技術(shù)難度較大。2010年，周生等建立了雞傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為該病新型疫苗的研制奠定了扎實的基礎(chǔ)[周生,?戴亞斌,?唐夢君等.?雞傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株全長cDNA感染性克隆的構(gòu)建.?中國家禽，2010，(23):?22-26.]。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的在于發(fā)明一種雞傳染性支氣管炎病毒致弱株，從而解決當(dāng)前所用IB疫苗株與流行株基因型不一致的問題。?

本發(fā)明雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ，已于2013年11月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC，中國，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所），其保藏編號為CGMCC?No.8501，分類命名為傳染性支氣管炎病毒,?拉丁文學(xué)名為Infectious?Bronchitis?Virus。?

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ的構(gòu)建方法：?