[發明專利]雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ及其構建方法

在審

• 申請號: 201310660009.0
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN104694488A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 周生;鄒劍敏;戴有理;戴亞斌;唐夢君;陳連頤;許明;姜逸;趙寶華;程旭
• 申請（專利權）人: 江蘇省家禽科學研究所;周生
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/09;C12N15/50;C12R1/93
• 代理公司: 北京連和連知識產權代理有限公司 11278
• 代理人: 奚衡寶

1.雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ，其微生物保藏號為CGMCC?No.?8501。

2.根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ的構建方法，其特征在于：采用雞傳染性支氣管炎病毒分離株ck/CH/IBYZ/2011的纖突蛋白基因S對H120疫苗株基因組的對應部分進行替換，通過反向遺傳操作技術拯救獲得重組病毒rH120-YZ。

3.根據權利要求2所述雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ的構建方法，其特征在于包括以下具體步驟：

[1]?傳染性支氣管炎病毒分離株纖突蛋白基因S的克隆

構建陽性質粒pMDYZS：采用RT-PCR擴增傳染性支氣管炎病毒分離株ck/CH/IBYZ/2011基因組20314nt～23887nt位置的S基因片段，將S基因片段與pMD18T載體進行連接，獲得陽性質粒pMDYZS，

用于上述S基因擴增的引物序列為：

YZSF：5’GGGTCTCGAACAAAAGACCGACT?3’

YZSR：5’TGGTCTCGGACGCGGGAGTTTG?3’；

[2]?構建分離株S基因替換H120疫苗株基因組對應部分的全長cDNA

將包含有傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株基因組片段的重組質粒及pMDYZS，采用BsaI限制性內切酶酶切后，在體外進行定向連接，構建ck/CH/IBYZ/2011株S基因替換H120疫苗株基因組對應部分的全長cDNA；

[3]?重組病毒rH120-YZ的拯救

將步驟[2]構建的全長基因組cDNA在體外轉錄成RNA后，轉染病毒復制許可的宿主細胞，轉染48h后收獲宿主細胞及其上清液，接種于9～11日齡的SPF雞胚，即拯救獲得雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ。

4.根據權利要求3所述的雞傳染性支氣管炎病毒致弱株rH120-YZ的構建方法，其特征在于步驟[2]中，將pMDYZS及傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株基因組的陽性質粒，利用質粒兩端的BsaI限制性內切酶酶切后，在體外進行定向連接，從而構建S基因替換H120疫苗株基因組對應部分的全長cDNA。